Prezent†Adresă curentă: OX11 0DE, Regatul Unit, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Regatul Unit, Diamond Light Source Co., Ltd., Centrul Electronic de Imagistică Biologică.
Complexul 1 de recoltare a luminii din centrul de reacție (RC-LH1) este componenta fotosintetică centrală a bacteriilor fototrofe purpurii. Am introdus două structuri de crio-microscopie electronică ale complexului RC-LH1 de la Rhodopseudomonas palustris. Structura cu rezoluție de 2,65 Å a complexului RC-LH114-W constă din 14 bucle LH1 cu subunități care înconjoară RC, care este întreruptă de proteina W, în timp ce complexul fără proteina W are o compoziție complet RC înconjurată de RC. Bucla LH1 închisă cu 16 subunități. Compararea acestor structuri oferă informații despre dinamica chinonei în complexul RC-LH1, inclusiv modificări conformaționale nedeterminate anterior la legarea chinonei la situsul QB RC, precum și locația situsurilor auxiliare de legare a chinonei, care ajută la transmiterea acestora către RC. Structura unică a proteinei W previne închiderea buclei LH1, creând astfel un canal pentru accelerarea schimbului chinonă/chinolonă.
Energia furnizată de fotosinteză poate susține aproape toată viața de pe Pământ și are un mare potențial pentru biotehnologia solară. Deși promovează fotosinteza globală, bacteriile fototrofe purpurii prezintă, de asemenea, diverse moduri energetice și capacități metabolice. Ele pot evita fotosinteza și pot crește ca bacterii heterotrofe în întuneric, pot fixa azot și dioxid de carbon, pot produce hidrogen și pot degrada compuși aromatici (1-3). Pentru a furniza energie pentru aceste procese, lumina trebuie convertită rapid și eficient în energie chimică. Acest proces începe atunci când complexul antenei care captează lumina absoarbe lumina și transferă energia captată către centrul de reacție (RC), începând astfel separarea sarcinii (4-7). Unitatea de bază a fotosintezei la bacteriile fototrofe purpurii este compusă din RC de tip 2, înconjurată de complexul de captare a luminii 1 (LH1), formând complexul central RC-LH1. LH1 este format dintr-o serie de heterodimeri αβ curbați, fiecare dintre aceștia leagă două molecule de clorofilă bacteriană (BChl) a și unul sau doi carotenoizi (8-12). Cea mai simplă antenă LH1 constă din 16 sau 17 heterodimeri αβ care înconjoară RC (9-13) într-o buclă închisă, dar în alte complexe centrale, peptidele transmembranare întrerup continuitatea LH1-ului înconjurător, promovând astfel difuzia chinol/chinonă între RC și complexul citocromului bc1 (11, 13-15). Planta fototrofă purpurie Rhodopseudomonas (Rps.) este un organism model care poate înțelege transferul de energie și electroni care susține fotosinteza. Prima structură cristalină a Rps. Modelul complexului RC-LH1 din palustris este RC, înconjurat de 15 bucle LH1 heterodimerice, care sunt întrerupte de o proteină necunoscută numită „Proteina W” (14). Proteina W a fost ulterior identificată ca RPA4402, care este o proteină necaracterizată de 10,5 kDa cu trei helixuri transmembranare (TMH) prezise (16). Propunem redenumirea genei rpa4402 care codifică proteina W în pufW pentru a fi consecventă cu nomenclatura utilizată pentru genele care codifică subunitățile RC-L, M (pufL, pufM) și LH1α, β (pufA, pufB). Interesant este că proteina W este prezentă doar în aproximativ 10% din RC-LH1, ceea ce dezvăluie că Rps. palustris produce două complexe RC-LH1 diferite. Aici, raportăm structurile cryo-EM (cryo-EM) de înaltă rezoluție a două complexe centrale, unul cu proteina W și 14 heterodimeri αβ, celălalt fără proteina W și o buclă închisă LH1 cu 16 heterodimeri. Structura noastră reprezintă o schimbare radicală în înțelegerea complexului RC-LH1 al Rps. palustris, deoarece am analizat populația omogenă a fiecărei variante și avem o rezoluție suficientă pentru a atribui clar fiecărei peptide și pigmenților legați, precum și lipidelor și chinonelor înrudite. Compararea acestor structuri arată că cele trei proteine ​​TMH-W, care nu au fost găsite până în prezent în niciun alt complex RC-LH1, generează un canal de chinonă pentru a accelera schimbul de chinonă/chinolonă. Au fost identificate o serie de situsuri conservate de legare a lipidelor și chinonei și am relevat o nouă modificare conformațională după combinarea chinonei și RC, care ar putea fi potrivită pentru RC-ul fotosistemului II (PSII) al organismelor fototrofe oxigenate. Constatările noastre oferă noi perspective asupra cineticii legării și schimbului de chinonă/chinolonă în complexul central RC-LH1 al bacteriilor fototrofe purpurii.
Pentru a facilita un studiu detaliat al celor două complexe găsite în Rps. palustris, izolăm fiecare RC-LH1 prin metode biochimice. Complexul deficitar în proteina W (denumit în continuare ΔpufW) a fost purificat din tulpina căreia îi lipsește gena pufW (16) și poate fi produs un singur complex RC-LH1. Complexul care conține proteina W este produs de o tulpină. Proteina W a acestei tulpini este modificată cu o etichetă His 10x la capătul său C-terminal, astfel încât complexul care conține proteina W poate fi combinat eficient cu majoritatea proteinelor W lipsitoare prin imobilizarea metalului. Complexul este separat eficient (16) prin cromatografie de afinitate (IMAC).
Așa cum se arată în Figura 1, ambele complexe conțin un RC format din trei subunități (RC-L, RC-M și RC-H) înconjurat de o antenă LH1. Structura de 2,80 Å a complexului lipsit de proteina W prezintă 16 heterodimeri αβ, formând o buclă LH1 închisă care înconjoară complet RC, denumită în continuare complex RC-LH116. Structura de 2,65 Å a complexului care conține proteina W are un LH1 cu 14 heterodimeri întrerupți de proteina W, denumit în continuare RC-LH114-W.
(A și B) Reprezentarea suprafeței compusului. (C și D) Pigmenți legați exprimați în bastonașe. (E și F) Complexele observate de pe suprafața citoplasmatică au peptidele și subunitățile LH1 reprezentate în desene animate și sunt numerotate în sensul acelor de ceasornic de la distanța dintre proteinele W [în concordanță cu numerotarea Rba. Complexul sphaeroides (13)]. Pentru LH1-α, culoarea subunității proteice este galbenă; pentru LH1-β, culoarea subunității proteice este albastră; pentru proteina-W, proteina este roșie; pentru RC-H, este cyan; pentru RC-L, este portocalie; pentru RC-M, magenta. Cofactorii sunt reprezentați prin bastonașe, verdele reprezintă moleculele BChl și BPh a, violetul reprezintă carotenoizii, iar galbenul reprezintă moleculele UQ10. (G și H) Vedere mărită a distanței dintre proteinele W în regiunea echivalentă a complexului RC-LH114-W (G) și a complexului RC-LH116 (H). Cofactorii sunt reprezentați sub formă de umplere a spațiului, chinona chelată este reprezentată în albastru. Spațiul proteina-W este evidențiat printr-o linie punctată albastră în (G), iar găurile mici unde chinona/chinololul difuzează pe inelul LH116 sunt evidențiate printr-o linie punctată neagră în (H).
Figura 1 (A și B) prezintă RC înconjurat de rețele deschise sau închise de heterodimeri LH1αβ, fiecare dintre aceștia leagă două BChl și un carotenoid (Figura 1, C și D). Studiile anterioare au arătat că Rps este complexul LH1. În calea biosintetică a xantinei de spirulină, aceste specii conțin populații mixte de carotenoizi (17). Cu toate acestea, spiropiroxantina este carotenoidul dominant, iar densitatea sa este satisfăcătoare. Prin urmare, am ales să modelăm spiroxantina la toate situsurile de legare a LH1. Polipeptidele alfa și beta sunt TMH-uri individuale cu regiuni exterioare scurte ale membranei (Figura 1, A, B, E și F). Deși densitatea de 17 reziduuri la capătul C nu a fost observată, polipeptida alfa a fost scindată de la Met1 la Ala46 în ambele complexe. Polipeptida β a fost redusă de la Gly4 la Tyr52 în RC-LH116 și de la Ser5 la Tyr52 în RC-LH114-W. Nu s-a observat nicio densitate de 3 sau 4 reziduuri N-terminale sau 13 reziduuri C-terminale (Figura S1). Analiza prin spectrometrie de masă a complexului mixt RC-LH1 preparat din tulpina de tip sălbatic a arătat că regiunea lipsă a fost rezultatul scindării heteroloage a acestor peptide (Figura S1 și S2). De asemenea, a fost observată formilarea N-terminală a α-Met1 (f). Analiza a arătat că α-peptida constă din reziduurile fMet1 până la Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, iar β-peptida constă din reziduurile Ser2 până la Ala53, ceea ce este în bună concordanță cu harta densității EM la temperatură joasă.
Coordonarea dintre α-His29 și β-His36 face ca BChl-urile să fie față în față; fiecare heterodimer αβ se asamblează cu vecinii săi pentru a forma o buclă deschisă (RC-LH114-W) sau o buclă închisă (RC-LH116) în jurul matricei de pigmenți cuplați cu excitoni RC (Figura 1, C și D). Comparativ cu banda de 877 nm a RC-LH114-W, deplasarea spre roșu la absorbție la 880 nm a RC-LH116 este de 3 nm (Figura 2A). Cu toate acestea, spectrul de dicroism circular este aproape același (Figura 2B), indicând faptul că, deși există o diferență clară între buclele deschise și cele închise, mediul local al BChl-urilor este foarte similar. Deplasarea spre roșu la absorbție poate fi rezultatul reducerii mișcării termice și al creșterii stabilității în bucla închisă (18, 19), al modificării cuplării pigmenților cauzate de bucla închisă (20, 21) sau al unei combinații a acestor două efecte (11).
(A) Spectru de absorbție ultraviolet/vizibil/infraroșu apropiat, ale cărui vârfuri sunt marcate cu pigmenții corespunzători și normalizate la vârful BPh la 775 nm. (B) Spectru de dicroism circular normalizat la absorbanța BChl la 805 nm. (C și D) Spectre ΔA selectate din spectrele de absorbție rezolvate în timp ale complexului RC-LH114-W (C) și complexului RC-LH116 (D). Pentru o mai bună comparabilitate, toate spectrele sunt normalizate la ∆A de −A la 0,2 ps. (E) Rata de oxidare a citocromului c2 după iradiere în prezența diferitelor concentrații de UQ2 (vezi Figura S8 pentru date brute). (F) În celulele crescute sub lumină de intensitate scăzută, medie sau mare (10, 30 sau 300 μMm-2 s-1, respectiv), subunitățile proteinei W și RC-L din complexul purificat și raportul membranei separate. Se determină nivelul proteinei prin electroforeză pe gel de SDS-poliacrilamidă și imunotest (vezi Figura S9 pentru date brute). Se determină raportul față de complexul RC-LH114-W purificat. Raportul stoichiometric dintre RC-L și proteina-W din complex este de 1:1.
BChl-urile din poziția 1 în bucla deformată αβ14 a RC-LH114-W (Figura 1, A, C și E) sunt mai apropiate de donorul primar RC (P) cu 6,8 Å decât BChl-urile echivalente din RC-LH116 (Figura 1, B, D și F și Figura S3); cu toate acestea, cinetica de absorbție tranzitorie a celor două complexe arată că pentru RC-LH114-W și RC-LH116, constantele de timp de transfer al energiei de excitație de la LH1 la RC sunt de 40 ±4 și 44 ±3 ps (Figura 2). , C și D, Figura S4 și Tabelul S2). De asemenea, nu există o diferență semnificativă în transferul electronic în cadrul RC (Figura S5 și textul suplimentar aferent). Bănuim că strânsa corespondență a timpului de transfer de energie între LH1 și RC-P se datorează distanței, unghiului și energiei potențiale similare a majorității BChl-urilor din cele două bucle LH1. Se pare că explorarea modelului energetic LH1 pentru a atinge distanța minimă nu este mai rapidă decât transferul direct de energie de la situsurile suboptimale la RC. Bucla LH1 în buclă deschisă din RC-LH114-W poate suferi, de asemenea, o mișcare termică nesemnificativă în condiții de temperatură scăzută pentru analiza structurală și există o conformație a inelului αβ14 mai lungă la temperatura camerei, din distanța de pigmentare a βBChls la poziția RC1.
Complexul RC-LH116 conține 32 BChl și 16 carotenoizi, iar aranjamentul său general este același cu cel obținut de la Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), tulpina Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) și alge verzi (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). După aliniere, s-au observat doar mici abateri ale pozițiilor heterodimerilor αβ, în special 1-5, 15 și 16 (Figura S6). Prezența proteinei W are un impact semnificativ asupra structurii LH1. Cele trei TMH-uri ale sale sunt conectate prin bucle scurte, cu capătul N-terminal pe partea lumenului complexului și capătul C-terminal pe partea citoplasmatică (Figurile 1A și 3, A până la D). Proteina-W este în mare parte hidrofobă (Figura 3B), iar TMH2 și TMH3 interacționează cu LH1αβ-14 pentru a forma o suprafață transmembranară (Figura 3, B și E până la G). Interfața este compusă în principal din reziduuri Phe, Leu și Val în regiunea transmembranară. Aceste reziduuri sunt suprapuse cu aminoacizi hidrofobi și pigmenți αβ-14. Unele reziduuri polare contribuie, de asemenea, la interacțiune, inclusiv legătura de hidrogen dintre W-Thr68 și β-Trp42 pe suprafața cavității complexe (Figura 3, F și G). Pe suprafața citoplasmei, Gln34 este adiacent grupării ceto a carotenoizilor αβ-14. În plus, molecula de n-dodecil β-d-maltozidă (β-DDM) a fost separată, iar coada sa hidrofobă s-a extins până la interfața dintre proteina-W și αβ-14, iar coada lipidică poate fi localizată în organism. De asemenea, am observat că regiunile de rezoluție C-terminale ale proteinei W și RCH sunt foarte apropiate, dar nu în limitele formării unor interacțiuni specifice (Figura 1, A și E). Cu toate acestea, pot exista interacțiuni în aminoacizii C-terminali nerezolvați ai acestor două proteine, ceea ce poate oferi un mecanism pentru recrutarea proteinei W în timpul asamblării complexului RC-LH114-W.
(A) Proteina-W, care este orientată spre interfața cu LH1αβ14 sub formă de desen animat, are un lanț lateral în formă de tijă (roșu), afișat într-o parte a diagramei potențialului electrostatic (suprafață gri transparentă cu un nivel de contur de 0,13). (B) Proteina-W reprezentată printr-o suprafață colorată hidrofob. Zonele polare și încărcate sunt afișate în cyan, zonele hidrofobe sunt afișate în alb, iar zonele puternic hidrofobe sunt afișate în portocaliu. (C și D) Proteina-W reprezentată sub formă de desen animat, orientarea sa fiind aceeași ca în (A) (C) și rotită cu 180° (D). În funcție de poziția în secvență, reziduurile distincte adoptă o schemă de culori curcubeu, unde capătul N-terminal este albastru, iar capătul C-terminal este roșu. (E) Proteina-W în aceeași vedere ca în (A), iar reziduurile de la interfața proteinei-W:LH1 sunt reprezentate prin tije cu marcaje atașate. (F) Proteina-W este rotită cu 90° față de (E) și LH1αβ14 în reprezentarea desenată și față de reziduurile de la interfață în reprezentarea sub formă de bare. Reziduurile excedentare ale polipeptidei beta sunt etichetate. Cofactorul este prezentat ca o bară care se potrivește cu culoarea din Figura 1, β-DDM descompus este prezentat în gri, iar oxigenul este prezentat în roșu. (G) Imaginea din (F) este rotită cu 180°, cu reziduurile proeminente ale polipeptidei alfa marcate.
Proteina-W înlocuiește un heterodimer αβ (al 15-lea din Figura 1F), prevenind astfel închiderea buclei și înclinarea primilor trei heterodimeri αβ. S-a observat că unghiul maxim de înclinare al primului heterodimer αβ-1 față de normala filmului a fost de 25° până la 29° (Figura 1, A și E), care a fost format prin înclinarea de 2° până la 8° a αβ-1 în RC A. Un contrast puternic-LH116 (Figura 1, B și F). Al doilea și al treilea heterodimer sunt înclinați la 12° până la 22° și respectiv 5° până la 10°. Datorită împiedicării sterice a RC, înclinarea αβ-1 nu include a doua pereche de αβ (care corespunde celei de-a 16-a αβ din Figura 1F), formând astfel un spațiu clar în inelul LH1 (Figura 1, A și E). Din cauza lipsei a doi heterodimeri αβ, însoțită de pierderea a patru BChl și a doi carotenoizi, niciunul dintre carotenoizi nu se leagă de subunitatea răsucită αβ-1, rezultând un inel LH114-W care conține 13 carotenoizi (vegetariani) și 28 BChl. Estimările rezoluției locale a celor două complexe din regiunile de la αβ1 la 7 sunt mai mici decât cele ale restului buclei LH1, ceea ce poate reflecta plasticitatea inerentă a subunității LH1 adiacente situsului RC QB (Figura 4).
Imaginile cu RC-LH114-W (A și B) și RC-LH116 (C și D) sunt prezentate din aceeași vedere de sus/vedere laterală (A și B) (A și C) și din aceeași suprafață a cavității din Fig. 1 (B și D). Cheile colorate sunt afișate în dreapta.
Singurul alt complex central caracteristic cu un raport stoichiometric de 1:14 este dimerul Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Cu toate acestea, proteina W și PufX nu au o omologie evidentă și au un impact semnificativ asupra structurilor LH1 respective. PufX este un singur TMH cu un domeniu citoplasmatic N-terminal care interacționează cu partea citoplasmatică a subunității RC-H (13) într-o poziție corespunzătoare lui Rps. palustris LH116αβ-16. PufX creează un canal pentru schimbul de chinonă/chinolonă între RC-LH1 și complexul citocrom bcl și este prezent în toate complexele centrale Rba. sphaeroides (13). Deși interfața monomer-monomer este în Rba. Dimerul sphaeroides RC-LH1-PufX este situat în poziția de legare a proteinei W în RC-LH114-W, iar golul indus de PufX și proteina-W este într-o poziție echivalentă (Figura S7A). Golul din RC-LH114-W este, de asemenea, aliniat cu ipoteticul canal de chinonă (8) al Pseudomonas rosea LH1, care este format din peptide care nu sunt înrudite cu proteina W sau PufX (Figura S7B). În plus, canalul de chinonă din Blc. LH1 verde smarald format prin excluderea unei subunități γ (7) este situat într-o poziție similară (Figura S7C). Deși mediată de proteine ​​diferite, apariția acestor canale chinonă/chinolol într-o poziție comună în complexul RC-LH1 pare a fi un exemplu de evoluție convergentă, indicând faptul că golul creat de proteina W poate acționa ca un canal de chinonă.
Spațiul din bucla LH114-W permite formarea unei regiuni membranare continue între spațiul intern al complexului RC-LH114-W și membrana generală (Figura 1G), în loc să conecteze cele două domenii printr-un por proteic, așa cum se întâmplă în cazul proteinelor. Complexul RC-LH116 este similar cu un complex închis, asemănător unui ac Tch (22) (Figura 1H). Deoarece difuzia chinonei prin membrană este mai rapidă decât difuzia prin canalul proteic îngust, bucla deschisă LH114-W poate permite o rotație mai rapidă a chinonei RC decât bucla închisă LH116, iar difuzia chinonei în RC poate fi mai restricționată. Pentru a testa dacă proteina W afectează conversia chinonelor prin RC, am efectuat un test de oxidare a citocromului pe o anumită concentrație de ubichinonă 2 (UQ2) (un analog al UQ10 natural cu o coadă de izopren mai scurtă) (Figura 2E). Deși prezența chinonei chelate împiedică determinarea precisă a constantei aparente Michaelis (RC-LH114-W și RC-LH116 sunt potrivite pentru 0,2±0,1μM și respectiv 0,5±0,2μM), rata maximă a RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) este cu 28±5% mai mare decât cea a RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Inițial, am estimat că proteina W este prezentă în aproximativ 10% din complexul central (16); aici, ratele de ocupare ale celulelor de creștere în lumină slabă, medie și puternică sunt de 15 ± 0,6%, 11 ± 1% și respectiv 0,9 ± 0,5 % (Figura 2F). Compararea cantitativă a spectrometriei de masă a arătat că adăugarea etichetei de histidină nu a redus abundența relativă a proteinei W în comparație cu tulpinile de tip sălbatic (P = 0,59), deci aceste niveluri nu sunt un artefact al proteinei W modificate (Figura S10). Cu toate acestea, această ocupare scăzută a proteinei W în complexul RC-LH1 poate permite unor RC să se inverseze într-un ritm accelerat, atenuând astfel schimbul mai lent de chinonă/chinolonă în complexul RC-LH116. Am observat că rata ridicată de ocupare a luminii este inconsistentă cu datele transcriptomice recente, care indică faptul că expresia genei pufW crește în condiții de lumină puternică (Figura S11) (23). Diferența dintre transcripția pufW și încorporarea proteinei W în complexul RC-LH1 este confuză și poate reflecta reglarea complexă a proteinei.
În RC-LH114-W, sunt alocate 6 molecule de cardiolipină (CDL), 7 molecule de fosfatidilcolină (POPC), 1 moleculă de fosfatidilglicerol (POPG) și 29 de β-DDM, modelate în 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG și 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A și B). În aceste două structuri, CDL este aproape localizată pe partea citoplasmatică a complexului, în timp ce POPC, POPG și β-DDM sunt localizate în mare parte pe partea luminală. Două molecule de lipide și detergent au fost izolate în regiunea αβ-1 până la αβ-6 a complexului RC-LH114-W (Figura 5A), iar cinci au fost izolate în regiunea echivalentă a RC-LH116 (Figura 5B). Mai multe lipide au fost găsite pe cealaltă parte a complexului, în principal CDL, acumulate între RC și αβ-7 până la αβ-13 (Figura 5, A și B). Alte lipide și detergenți rezolvați structural sunt localizați în afara inelului LH1, iar lanțurile acil bine rezolvate se extind între subunitățile LH1, desemnate provizoriu ca β-DDM în RC-LH114-W și definite ca β-DDM în RC Un amestec de β-DDM și POPC-LH116. Pozițiile similare ale lipidelor și detergenților chelatori în structura noastră indică faptul că acestea sunt situsuri de legare relevante din punct de vedere fiziologic (Figura S12A). Pozițiile moleculelor echivalente în Tch au, de asemenea, o consistență bună. Tulpina Gentle și Trv. 970 RC-LH1 (Figura S12, B până la E) (9, 12) și reziduurile de legături de hidrogen ale grupului capului lipidic au prezentat o conservare destul de bună în alinierea secvenței (Figura S13), indicând faptul că CDL conservată care se leagă de RC (24), aceste situsuri pot fi conservate în complexul RC-LH1.
(A și B) Peptidele RC-LH114-W (A) și RC-LH116 (B) sunt reprezentate prin desene animate, iar pigmenții sunt reprezentați prin tije, folosind schema de culori din Figura 1. Lipidele sunt prezentate în roșu, iar detergenții sunt prezentați în gri. UQ legată de situsurile RC QA și QB este galbenă, în timp ce UQ izolată este albastră. (C și D) Aceleași vederi ca (A) și (B), cu lipidele omise. (E până la G) Vedere mărită a Q1(E), Q2(F) și Q3(G) din RC-LH116, cu lanțuri laterale care se influențează reciproc. Legăturile de hidrogen sunt prezentate ca linii negre punctate.
În RC-LH116, atât RC QA, cât și QB UQ, care participă la transferul de electroni în procesul de separare a sarcinii, sunt descompuse în locurile lor de legare. Cu toate acestea, în RC-LH114-W, chinona QB nu a fost rezolvată și va fi discutată în detaliu mai jos. Pe lângă chinonele QA și QB, două molecule UQ chelate (situate între inelele RC și LH1) sunt alocate în structura RC-LH114-W în funcție de grupările lor principale bine rezolvate (situate în Q1 și respectiv Q2). Figura 5C). Două unități de izopren sunt atribuite lui Q1, iar harta densității rezolvă cele 10 cozi complete de izopren ale lui Q2. În structura RC-LH116, trei molecule UQ10 chelate (Q1 până la Q3, Figura 5D) au fost rezolvate, iar toate moleculele au o densitate clară pe toată coada (Figura 5, D până la G). În cele două structuri, pozițiile grupurilor chinonice ale capului Q1 și Q2 au o consistență excelentă (Figura S12F) și interacționează doar cu RC. Q1 este situat la intrarea în spațiul W al RC-LH114-W (Figura 1G și 5, C, D și E), iar Q2 este situat în apropierea situsului de legare QB (Figura 5, C, D) și F). Reziduurile conservate L-Trp143 și L-Trp269 sunt foarte apropiate de Q1 și Q2 și oferă potențiale interacțiuni de π-stacking (Figura 5, E și F, și Figura S12). L-Gln88, la 3,0 Å de oxigenul distal al Q1, oferă o legătură de hidrogen puternică (Figura 5E); acest reziduu este conservat în toate RC-urile, cu excepția celei mai îndepărtate relații (Figura S13). L-Ser91 este substituit conservativ cu Thr în majoritatea celorlalte RC (Figura S13), se află la 3,8 Å de oxigenul metil al Q1 și poate furniza legături de hidrogen slabe (Figura 5E). Q3 nu pare să aibă o interacțiune specifică, dar este localizat în regiunea hidrofobă dintre subunitatea RC-M și subunitatea LH1-α 5 până la 6 (Figura 5, D și G). Q1, Q2 și Q3 sau chinonele chelate din apropiere au fost, de asemenea, separate în Tch. Gentle, Trv. Strain 970 și Blc. Structura irisului (9, 10, 12) indică un situs de legare auxiliar conservat al chinonei în complexul RC-LH1 (Figura S12G). Cele cinci UQ-uri descompuse în RC-LH116 sunt în bună concordanță cu valoarea de 5,8 ± 0,7 a fiecărui complex determinată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), în timp ce cele trei UQ-uri descompuse în RC-LH114-W sunt mai mici decât valoarea măsurată de 6,2 ± 0,3 (Fig. S14) indică faptul că există molecule UQ nerezolvate în structură.
Polipeptidele pseudo-simetrice L și M conțin fiecare câte cinci TMH-uri și formează un heterodimer care combină un dimer BChl, doi monomeri BChl, doi monomeri bacteriofag (BPh) și un fier non-hemic și una sau două molecule UQ10. Prin prezența legăturilor de hidrogen pe gruparea cetonică terminală și acumularea sa cunoscută în Rps, carotenoizii sunt încorporați în subunitatea M, care se numește cis-3,4-dehidroorhodopină. Specia (25). Domeniul membranei externe a RC-H este ancorat la membrană printr-un singur TMH. Structura generală RC este similară cu cea a celor trei subunități RC ale speciilor înrudite (cum ar fi Rba). sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Macrociclurile BChl și BPh, catena carotenoidă și fierul non-hemic se suprapun în intervalul de rezoluție al acestor structuri, la fel ca și gruparea principală UQ10 de la situsul QA și chinona QB de la RC-LH116 (Figura S15).
Disponibilitatea a două structuri RC cu rate diferite de ocupare a situsurilor QB oferă o nouă oportunitate de a examina modificările conformaționale consistente care însoțesc legarea chinonei QB. În complexul RC-LH116, chinona QB este localizată în poziția „proximală” complet legată (26), dar separarea RC-LH114-W nu conține chinonă QB. Nu există chinonă QB în RC-LH114-W, ceea ce este surprinzător deoarece complexul este activ, mai mult decât complexul RC-LH116 cu chinonă QB rezolvată structural. Deși cele două inele LH1 chelează aproximativ șase chinone, cinci sunt rezolvate structural în inelul RC-LH116 închis, în timp ce doar trei sunt limitate structural în inelul RC-LH114-W deschis. Această dezordine structurală crescută poate reflecta înlocuirea mai rapidă a situsurilor QB RC-LH114-W, cinetica mai rapidă a chinonei în complex și probabilitatea crescută de traversare a buclei LH1. Sugerăm că lipsa UQ în situsul RC QB al RC-LH114-W ar putea fi rezultatul unui complex mai complex și mai activ, iar situsul QB al RC-LH114-W a fost imediat înghețat în procesul de rotație a UQ. Etapa specifică (intrarea în situsul QB a fost închisă) reflectă conformația acestei activități.
Fără QB, rotația însoțitoare a L-Phe217 către o poziție incompatibilă cu legarea UQ10, deoarece va provoca o coliziune spațială cu prima unitate de izopren a cozii (Figura 6A). În plus, principalele modificări conformaționale evidente sunt evidente, în special helixul de (helix scurt în bucla dintre TMH D și E) unde L-Phe217 este deplasat către buzunarul de legare QB și rotația L-Tyr223 (Figura 6A) pentru a rupe legătura de hidrogen cu cadrul M-Asp45 și a închide intrarea în situsul de legare QB (Figura 6B). Helixul de pivotează la baza sa, Cα a L-Ser209 este deplasat cu 0,33 Å, în timp ce L-Val221Cα este deplasat cu 3,52 Å. Nu există modificări observabile în TMH D și E, care sunt suprapozabile în ambele structuri (Figura 6A). Din câte știm, aceasta este prima structură din RC naturală care închide situsul QB. O comparație cu structura completă (legată de QB) arată că, înainte ca chinona să fie redusă, este necesară o modificare conformațională pentru a o face să intre în chinonă. L-Phe217 se rotește pentru a forma o interacțiune π-stacking cu grupul principal al chinonei, iar helixul se deplasează spre exterior, permițând scheletului L-Gly222 și lanțului lateral al L-Tyr223 să formeze o rețea de legături de hidrogen cu o structură stabilă de legături de hidrogen (Figura 6, A și C).
(A) Desen animat suprapus al hologramei (lanțul L, lanțul portocaliu/M, magenta) și al structurii apo (gri), în care reziduurile cheie sunt afișate sub forma unei reprezentări asemănătoare unei tije. UQ10 este reprezentată printr-o bară galbenă. Linia punctată indică legăturile de hidrogen formate în întreaga structură. (B și C) Reprezentarea la suprafață a apolipoproteinei și a întregii structuri inelare, evidențiind oxigenul lanțului lateral al L-Phe217 în albastru și respectiv L-Tyr223 în roșu. Subunitatea L este portocalie; subunitățile M și H nu sunt colorate. (D și E) Apolipoproteină (D) și situsuri RC QB întregi (E) [colorate după (A) respectiv] și PSII Thermophilus thermophilus (verde, albastru cu chinonă plastică; ID PDB: 3WU2) Aliniere (58).
În mod neașteptat, deși sunt disponibile mai multe structuri de celule recidivante (RC) cu deficit de QB fără LH1, modificările conformaționale observate în acest studiu nu au fost raportate anterior. Acestea includ structura de depleție a QB de la Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) și Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), toate fiind aproape identice cu structura lor QB generală. O inspecție atentă a 3PRC a relevat că moleculele de detergent LDAO (lauril dimetil amină oxid) se leagă la intrarea în poziția QB, ceea ce poate împiedica rearanjarea într-o conformație închisă. Deși LDAO nu se descompune în aceeași poziție în 1EYS sau 1OGV, aceste RC sunt preparate folosind același detergent și, prin urmare, pot produce același efect. Structura cristalină a Rba. Sphaeroides RC co-cristalizat cu citocrom c2 (PDB ID: 1L9B) pare să aibă și el un situs QB închis. Cu toate acestea, în acest caz, regiunea N-terminală a polipeptidei RC-M (care interacționează cu situsul de legare QB prin legătura H a reziduului Tyr de pe helixul Q) adoptă o conformație nenaturală, iar modificarea conformațională QB nu este explorată în continuare (30). Ceea ce este liniștitor este faptul că nu am observat acest tip de deformare a polipeptidei M în structura RC-LH114-W, care este aproape aceeași cu regiunea N-terminală a RC RC-LH116. De asemenea, trebuie remarcat faptul că, după eradicarea antenei LH1 pe bază de detergent, RC-urile apolipoproteinice din PDB au fost rezolvate, ceea ce a eliminat rezervele interne de chinonă și lipidele din spațiul dintre RC și suprafața interioară a inelului LH1 înconjurător (31, 32). RC rămâne funcțional deoarece își păstrează toți cofactorii, cu excepția chinonei QB descompozabile, care este mai puțin stabilă și se pierde adesea în timpul procesului de preparare (33). În plus, se știe că îndepărtarea LH1 și a lipidelor ciclice naturale din RC poate avea un impact asupra funcțiilor, cum ar fi durata de viață scurtată a stării P+QB cu sarcină separată (31, 34, 35). Prin urmare, speculăm că existența inelului LH1 local care înconjoară RC poate menține situsul QB „închis”, păstrând astfel mediul local din apropierea QB.
Deși apolipoproteina (fără chinonă QB) și structura completă reprezintă doar două instantanee ale schimbării situsului QB, mai degrabă decât o serie de evenimente, există indicii că legarea poate fi controlată pentru a preveni relegarea de către hidrochinonă pentru a inhiba inhibarea substratului. Interacțiunea dintre chinolol și chinonă în apropierea situsului QB al apolipoproteinei poate fi diferită, ceea ce duce la respingerea acesteia de către RC. S-a propus de mult timp că modificările conformaționale joacă un rol în legarea și reducerea chinonelor. Capacitatea RC congelate de a reduce chinonele după adaptarea la întuneric este afectată (36); cristalografia cu raze X arată că această deteriorare se datorează faptului că chinonele QB sunt prinse într-o conformație „distală” la aproximativ 4,5 Å de poziția proximală activă (26), 37). Sugerăm că această conformație distală de legare este o instantanee a stării intermediare dintre apolipoproteină și structura inelară completă, care urmează interacțiunii inițiale cu chinona și deschiderii situsului QB.
RC de tip II găsit în complexul PSII al anumitor bacterii și cianobacterii fototrofe, alge și plante prezintă conservare structurală și funcțională (38). Alinierea structurală prezentată în Figura 6 (D și E) subliniază similaritatea dintre RC PSII și situsul QB al complexului RC bacterian. Această comparație a fost mult timp un model pentru studierea sistemelor strâns legate de legarea și reducerea chinonei. Publicațiile anterioare au sugerat că modificările conformaționale sunt însoțite de reducerea PSII a chinonelor (39, 40). Prin urmare, având în vedere conservarea evolutivă a RC, acest mecanism de legare neobservat anterior poate fi aplicabil și situsului QB al RC PSII în plantele fototrofe oxigenate.
Tulpinile Rps ΔpufW (deleție pufW nemarcată) și PufW-His (proteină W marcată cu 10x His la capătul C-terminal, exprimată din locusul pufW natural). palustris CGA009 a fost descrisă în lucrarea noastră anterioară (16). Aceste tulpini și tulpina parentală izogenă de tip sălbatic au fost recuperate din congelator prin strierea unui număr mic de celule pe o placă PYE (fiecare 5 g litru -1) (depozitată în LB la -80 °C, conținând 50% (g/v) glicerol) proteină, extract de drojdie și succinat) agar [1,5% (g/v)]. Placa a fost incubată peste noapte la întuneric la temperatura camerei în condiții anaerobe, apoi iluminată cu lumină albă (~50 μmolm-2 s-1) furnizată de becuri cu halogen OSRAM 116-W (RS Components, Marea Britanie) timp de 3 până la 5 zile, până când a apărut o singură colonie. O singură colonie a fost utilizată pentru a inocula 10 ml de mediu M22+ (41) suplimentat cu 0,1% (g/v) casaminoacizi (denumit în continuare M22). Cultura a fost crescută în condiții de oxigen scăzut, la întuneric, la 34°C, sub agitare la 180 rpm, timp de 48 de ore, iar apoi 70 ml din cultură au fost inoculați în aceleași condiții timp de 24 de ore. O cultură semi-aerobă cu un volum de 1 ml este utilizată pentru a inocula 30 ml de mediu M22 într-o sticlă universală din sticlă transparentă cu dop filetat de 30 ml și iradiată cu agitare (~50 μmolm-2 s-1) timp de 48 de ore prin intermediul unei tije de agitare cu forță magnetică sterilă. Apoi, 30 ml din cultură au fost inoculați cu aproximativ 1 litru de cultură în aceleași condiții, care a fost apoi utilizat pentru a inocula aproximativ 9 litri de cultură iluminată la ~200 μmolm-2 s-1 timp de 72 de ore. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 7132 RCF timp de 30 de minute, resuspendate în ~10 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) și depozitate la -20°C până la utilizare.
După decongelare, se adaugă câteva cristale de dezoxiribonuclează I (Merck, Marea Britanie), lizozim (Merck, Marea Britanie) și două tablete de inhibitor de protează holoenzimă Roche (Merck, Marea Britanie) la celulele resuspendate. Într-o celulă de presiune franceză de 20.000 psi (Aminco, SUA), celulele au fost disrupate de 8 până la 12 ori. După îndepărtarea celulelor nedistruse și a resturilor insolubile prin centrifugare la 18.500 RCF timp de 15 minute la 4°C, membrana a fost precipitată din lizatul pigmentat prin centrifugare la 113.000 RCF timp de 2 ore la 43.000°C. Se aruncă fracția solubilă și se resuspenda membrana colorată în 100 până la 200 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) și se omogenizează până când nu mai există agregate vizibile. Membrana suspendată a fost incubată în 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, SUA) conținând 2% (g/v) β-DDM timp de 1 oră la întuneric la 4°C, sub agitare ușoară. Apoi, se centrifughează la 70°C pentru a dizolva 150.000 RCF la 4°C timp de 1 oră pentru a îndepărta substanțele insolubile reziduale.
Membrana solubilizantă de la tulpina ΔpufW a fost aplicată pe o coloană de schimb ionic DEAE Sepharose de 50 ml cu trei volume de coloană (CV) de tampon de legare [20 mM tris-HCl (pH 8,0) conținând 0,03% (g/v) β-DDM]. Se spală coloana cu două tampoane de legare CV, apoi se spală coloana cu două tampoane de legare conținând 50 mM NaCl. Complexul RC-LH116 a fost eluat cu un gradient liniar de 150 până la 300 mM NaCl (în tampon de legare) la 1,75 CV, iar complexul de legare rămas a fost eluat cu un tampon de legare conținând 300 mM NaCl la 0,5 CV. Se colectează spectrul de absorbție între 250 și 1000 nm, se păstrează fracția cu raportul de absorbție (A880/A280) mai mare de 1 la 880 până la 280 nm, se diluează de două ori în tamponul de legare și se utilizează aceeași procedură din nou pe coloana DEAE la purificare. Se diluează fracțiile cu raporturi A880/A280 mai mari de 1,7 și raporturi A880/A805 mai mari de 3,0, se efectuează a treia rundă de schimb ionic și se păstrează fracțiile cu raporturi A880/A280 mai mari de 2,2 și raporturi A880/A805 mai mari de 5,0. Complexul parțial purificat a fost concentrat la ~2 ml într-un filtru centrifugal Amicon cu o greutate moleculară limită de 100.000 (MWCO) (Merck, Marea Britanie) și încărcat pe o coloană de excludere dimensională Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, SUA) conținând tampon NaCl 200 mM, apoi eluat în același tampon la 1,5 CV. Se colectează spectrele de absorbție ale fracției de excludere dimensională și se concentrează spectrele de absorbție cu raporturi A880/A280 peste 2,4 și raporturi A880/A805 peste 5,8 până la 100 A880 și se utilizează imediat pentru prepararea sau depozitarea grilei cryo-TEM. Se păstrează la -80°C până la utilizare.
Membrana solubilizantă din tulpina PufW-His a fost aplicată pe o coloană HisPrep FF Ni-NTA Sepharose de 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) conținând 200 mM NaCl și 0,03% (g/g)) în tampon IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Coloana a fost spălată cu cinci CV de tampon IMAC și apoi cu cinci CV de tampon IMAC conținând 10 mM histidină. Complexul central a fost eluat din coloană cu cinci tampoane IMAC conținând 100 mM histidină. Fracția care conține complexul RC-LH114-W este concentrată la ~10 ml într-un rezervor agitat echipat cu un filtru Amicon 100.000 MWCO (Merck, Marea Britanie), diluată de 20 de ori cu tampon de legare și apoi adăugată la 25 ml. În coloana DEAE Sepharose, se utilizează în prealabil patru CV legate de tampon. Se spală coloana cu patru soluții tampon de legare CV, apoi se eluează complexul pe opt CV-uri pe un gradient liniar de 0 până la 100 mM NaCl (în soluție tampon de legare), iar celelalte patru CV-uri conținând soluție tampon de legare 100 mM. Complexele reziduale eluate pe fracțiile de clorură de sodiu combinată cu raportul A880/A280 mai mare de 2,4 și raportul A880/A805 mai mare de 4,6 au fost concentrate la ~2 ml într-un filtru centrifugal Amicon 100.000 MWCO și umplute cu o coloană de excludere dimensională Superdex 200 16/600 echilibrată în prealabil cu IMAC de 1,5 CV, și apoi se eluează în aceeași soluție tampon peste 1,5 CV. Se colectează spectrele de absorbție ale fracțiilor de excluziune dimensională și se concentrează spectrele de absorbție cu raporturi A880/A280 peste 2,1 și raporturi A880/A805 peste 4,6 până la 100 A880, care sunt utilizate imediat pentru prepararea grilei TEM congelate sau depozitate la -80°C până la necesitate.
Un congelator de imersie Leica EM GP a fost utilizat pentru a prepara grile TEM la temperatură joasă. Complexul a fost diluat în tampon IMAC până la A880 de 50, iar apoi 5 μl au fost încărcați pe o plasă de cupru acoperită cu carbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 recent descărcată prin incandescență (Agar Scientific, Marea Britanie). Se incubează grila la 20°C și 60% umiditate relativă timp de 30 de secunde, apoi se usucă prin tamponare timp de 3 secunde și apoi se stinge în etan lichid la -176°C.
Datele complexului RC-LH114-W au fost înregistrate pe eBIC (Electronic Biomaging Center) (British Diamond Light Source) cu un microscop Titan Krios, care funcționează la o tensiune de accelerare de 300kV, cu o mărire nominală de 130.000× și o energie de -. Se alege un interval de 20 eV. Un Gatan 968 GIF Quantum cu detector de vârf K2 a fost utilizat pentru a înregistra imagini în modul de numărare pentru colectarea datelor. Dimensiunea pixelului calibrat este de 1,048 Å, iar rata dozei este de 3,83 e-Å⁻²s⁻¹. Filmul a fost colectat în 11 secunde și împărțit în 40 de părți. S-a folosit zona acoperită cu carbon pentru a refocaliza microscopul, apoi s-au colectat trei filme per gaură. În total, au fost colectate 3130 de filme, cu valori de defocalizare între -1 și -3 μm.
Datele pentru complexul RC-LH116 au fost colectate folosind același microscop la Laboratorul de Biostructură Asterbury (Universitatea din Leeds, Marea Britanie). Datele au fost colectate în mod de numărare cu o mărire de 130 k, iar dimensiunea pixelului a fost calibrată la 1,065 Å cu o doză de 4,6 e-Å-2s-1. Filmul a fost înregistrat în 12 secunde și împărțit în 48 de părți. În total, au fost colectate 3359 de filme, cu valori de defocalizare între -1 și -3 μm.
Toată procesarea datelor se efectuează în cadrul pipeline-ului Relion 3.0 (42). Se utilizează Motioncorr 2 (43) pentru a corecta mișcarea fasciculului prin ponderarea dozei, apoi se utilizează CTFFIND 4.1 (44) pentru a determina parametrul CTF (funcția de transfer a contrastului). Microfotografiile tipice după aceste etape inițiale de procesare sunt prezentate în Figura 2. S16. Șablonul de selecție automată este generat prin selectarea manuală a aproximativ 250 de pixeli din 1000 de particule într-un cadru de 250 de pixeli și fără o clasificare bidimensională (2D) de referință, respingând astfel acele clasificări care îndeplinesc criteriile de contaminare a probei sau nu au caracteristici discernabile. Apoi, selecția automată a fost efectuată pe toate microfotografiile, iar complexul RC-LH114-W a avut 849.359 de particule, iar complexul RC-LH116 a avut 476.547 de particule. Toate particulele selectate au fost supuse a două runde de clasificare 2D fără referință, iar după fiecare rundă, particulele care îndeplinesc zona de carbon, contaminarea probei, fără caracteristici evidente sau particule care se suprapun puternic sunt respinse, rezultând 772.033 (90,9%) și respectiv 359.678 (75,5%) particule. Pentru clasificarea 3D a particulelor RC-LH114-W și RC-LH116 sunt utilizate modelul 3D de referință inițial a fost generat folosind metoda coborârii gradientului stocastic. Folosind modelul inițial ca referință, particulele selectate sunt clasificate în patru categorii în 3D. Folosind modelul din această categorie ca referință, se efectuează rafinarea 3D pe particulele din cea mai mare categorie, apoi se utilizează filtrul inițial trece-jos de 15 Å pentru a acoperi zona solventului, se adaugă 6 pixeli cu margini moi și se post-procesează pixelii pentru a corecta funcția de transfer a modulației de vârf Gatan K2 a detectorului superior. Pentru setul de date RC-LH114-W, acest model inițial a fost modificat prin eliminarea densității puternice de la marginile măștii (deconectată de densitatea complexă a miezului în UCSF Chimera). Modelele rezultate (rezoluțiile RC-LH114-W și RC-LH116 sunt de 3,91 și respectiv 4,16 Å) sunt utilizate ca referință pentru a doua rundă de clasificare 3D. Particulele utilizate sunt grupate în clasa 3D inițială și nu prezintă o corelație puternică cu vecinătatea. Suprapunere sau absența caracteristicilor structurale evidente. După a doua rundă de clasificare 3D, a fost selectată categoria cu cea mai mare rezoluție [Pentru RC-LH114-W, o categorie este de 377.703 particule (44,5%), pentru RC-LH116, există două categorii, însumând 260.752 particule (54,7%), unde acestea sunt identice doar atunci când sunt aliniate după rotația inițială, cu o mică diferență]. Particulele selectate sunt reextrase într-o cutie de 400 de pixeli și rafinate prin rafinare 3D. Masca solventului este generată folosind filtrul inițial low-pass de 15 Å, expansiunea hărții de 3 pixeli și o mască moale de 3 pixeli. Folosind rafinarea CTF per particulă, corecția mișcării per particulă și a doua rundă de rafinare CTF per particulă, rafinarea 3D, mascarea solventului și post-procesarea sunt efectuate după fiecare etapă pentru a rafina în continuare textura rezultată. Folosind valoarea limită FSC (Coeficientul de corelație Fourier Shell) de 0,143, rezoluțiile modelelor finale RC-LH114-W și RC-LH116 sunt de 2,65 și respectiv 2,80 Å. Curba FSC a modelului final este prezentată în Figura 2. S17.
Toate secvențele proteice sunt descărcate de pe UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) a fost utilizat pentru a construi un model de omologie al RC, care conține secvențele proteice ale RC-L, RC-M și RC-H și structura cristalină a Rba. sphaeroides RC a fost utilizat ca șablon (PDB ID: 5LSE) (46). Folosiți instrumentul „fit map” din UCSF Chimera pentru a potrivi modelul generat pe hartă (47), a îmbunătăți structura proteinei și a adăuga cofactorul [4×BChl a (denumirea reziduurilor din biblioteca de monomeri = BCL), 2×BPh a (BPH), unul sau două tipuri de UQ10 (U10), un fier non-hemic (Fe) și o 3,4-dihidrohexacarbonilcolină (QAK)]. Folosiți Coot (48) pentru adăugare. Deoarece QAK nu este disponibil în biblioteca de monomeri, acesta a fost parametrizat folosind instrumentul eLBOW din PHENIX (49).
Apoi, a fost construită subunitatea LH1. Inițial, instrumentul de construcție automată din PHENIX (49) a fost utilizat pentru a construi automat o parte a secvenței LH1 folosind harta și secvențele proteice LH1-α și LH1-β ca date de intrare. Selectați subunitatea LH1 cea mai completă, extrageți-o și încărcați-o în Coot, adăugați manual secvența lipsă din ea și rafinați manual întreaga structură înainte de a adăuga două BCl a (BCL) și o spiriloxantină (CRT) [conform Rps relevante. Densitatea complexului LH1 și conținutul de carotenoizi cunoscut. Specia (17)]. Copiați subunitatea LH1 completă și utilizați „Docking Map Tool” din UCSF Chimera pentru a o andoca în zona adiacentă non-model a densității LH1, apoi rafinați-o în Coot; repetați procesul până când toate subunitățile LH1 au fost modelate. Pentru structura RC-LH114-W, prin extragerea densității nealocate în Coot, proteina este segmentată de componentele non-proteice rămase în harta USCF Chimera, iar instrumentul Autobuild este utilizat pentru a stabili modelul inițial și modelarea subunităților rămase (proteina-W). În PHENIX (49). Adăugați orice secvențe lipsă la modelul rezultat în Coot (48), apoi rafinați manual întreaga subunitate. Densitatea nealocată rămasă se potrivește combinației de lipide (ID-ul bibliotecii de monomeri PDB CDL = CDL, POPC = 6PL și POPG = PGT), detergent β-DDM (LMT) și molecule UQ10 (U10). Utilizați optimizarea PHENIX (49) și optimizarea manuală în Coot (48) pentru a perfecționa modelul inițial complet până când statisticile modelului și calitatea vizuală a ajustării nu pot fi îmbunătățite în continuare. În cele din urmă, utilizați LocScale (50) pentru a clarifica harta locală, apoi efectuați alte câteva cicluri de modelare a densității nealocate și optimizare automată și manuală.
Peptidele, cofactorii și alte lipide și chinone andocate în densitățile lor respective sunt prezentate în Figurile 1 și 2, S18 până la S23. Informațiile statistice ale modelului final sunt prezentate în Tabelul S1.
Dacă nu se specifică altfel, spectrele de absorbție UV/Vis/NIR au fost colectate pe un spectrofotometru Cary60 (Agilent, SUA) la intervale de 1 nm de la 250 nm la 1000 nm și un timp de integrare de 0,1 s.
Se diluează proba într-o cuvetă de cuarț cu o traiectorie de 2 mm până la A880 de 1 și se colectează spectrul de absorbție între 400 și 1000 nm. Spectrele dicroice circulare au fost colectate pe un spectropolarimetru Jasco 810 (Jasco, Japonia) la intervale de 1 nm între 400 nm și 950 nm, la o rată de scanare de 20 nm min-1.
Coeficientul molar de extincție este determinat prin diluarea complexului central la un A880 de aproximativ 50. Se diluează volumul de 10 μl în 990 μl de tampon de legare sau metanol și se colectează imediat spectrul de absorbție pentru a minimiza degradarea BChl. Conținutul de BChl al fiecărei probe de metanol a fost calculat prin coeficientul de extincție la 771 nm de 54,8 mM-1 cm-1, iar coeficientul de extincție a fost determinat (51). Se împărți concentrația măsurată de BChl la 32 (RC-LH114-W) sau 36 (RC-LH116) pentru a determina concentrația complexului central, care este apoi utilizată pentru a determina spectrul de absorbție al aceleiași probe colectate în tamponul paralel. Coeficientul de extincție a fost efectuat trei măsurători repetate pentru fiecare probă, iar absorbanța medie a maximului Qy al BChl a fost utilizată pentru calcul. Coeficientul de extincție al RC-LH114-W măsurat la 878 nm este de 3280±140 mM-1 cm-1, în timp ce coeficientul de extincție al RC-LH116 măsurat la 880 nm este de 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 a fost cuantificat conform metodei din (52). Pe scurt, HPLC în fază inversă (RP-HPLC) a fost efectuată utilizând sistemul HPLC Agilent 1200. Se dizolvă aproximativ 0,02 nmol de RC-LH116 sau RC-LH114-W în 50 μl de metanol:cloroform 50:50 conținând 0,02% (g/v) clorură ferică și se injectează Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm preechilibrat. Se dizolvă în 1 ml-1 min-1 la 40°C în solvent HPLC (80:20 metanol:2-propanol) pe o coloană de ×25 cm. Se efectuează eluție izocratică într-un solvent HPLC pentru a monitoriza absorbanța la 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoizi) și 780 nm (BChl) timp de 1 oră. Vârful din cromatograma de 275 nm la 25,5 minute a fost integrat, aceasta neconținând alți compuși detectabili. Aria integrată este utilizată pentru a calcula cantitatea molară de UQ10 extrasă cu referire la curba de calibrare calculată din injectarea standardelor pure de la 0 la 5,8 nmol (Figura S14). Fiecare probă a fost analizată în trei replici, iar eroarea raportată corespunde deviației standard a mediei.
O soluție conținând complexul RC-LH1 cu o absorbție Qy maximă de 0,1 a fost preparată cu 30 μM citocrom c2 redus din inimă de cal (Merck, Marea Britanie) și 0 până la 50 μMUQ2 (Merck, Marea Britanie). Trei probe de 1 ml au fost preparate la fiecare concentrație de UQ2 și incubate peste noapte la întuneric la 4°C pentru a asigura o adaptare completă la întuneric înainte de măsurare. Soluția a fost încărcată într-un spectrofotometru modular OLIS RSM1000 echipat cu o flacără de 300 nm/rețea de 500 de linii, o intrare de 1,24 mm, o fante de 0,12 mm la mijloc și o fante de ieșire de 0,6 mm. Un filtru de trecere lungă de 600 nm este plasat la intrarea în fototubul pentru probă și în tubul fotomultiplicator de referință pentru a exclude lumina de excitație. Absorbanța a fost monitorizată la 550 nm cu un timp de integrare de 0,15 s. Lumina de excitație este emisă de LED-ul (diodă emițătoare de lumină) M880F2 de 880 nm (Thorlabs Ltd., Marea Britanie) printr-un cablu cu fibră optică la o intensitate de 90% prin intermediul unui controler DC2200 (Thorlabs Ltd., Marea Britanie) și este emisă către sursa de lumină la un unghi de 90°. Fasciculul de măsurare este opus oglinzii pentru a returna orice lumină care nu a fost inițial absorbită de probă. Monitorizați absorbanța cu 10 s înainte de iluminarea de 50 s. Apoi, absorbanța a fost monitorizată în continuare timp de 60 s în întuneric pentru a evalua măsura în care chinololul reduce spontan citocromul c23+ (vezi Figura S8 pentru date brute).
Datele au fost procesate prin ajustarea unei rate inițiale liniare în intervalul de 0,5 până la 10 s (în funcție de concentrația UQ2) și prin medierea ratelor tuturor celor trei probe la fiecare concentrație de UQ2. Concentrația RC-LH1 calculată prin coeficientul de extincție respectiv a fost utilizată pentru a converti rata în eficiență catalitică, reprezentată grafic în Origin Pro 2019 (OriginLab, SUA) și ajustată la modelul Michaelis-Menten pentru a determina valorile aparente Km și Kcat.
Pentru măsurătorile de absorbție tranzitorie, proba RC-LH1 a fost diluată la ~2 μM în tampon IMAC conținând 50 mM ascorbat de sodiu (Merck, SUA) și 0,4 mM terbutină (Merck, SUA). Acidul ascorbic este utilizat ca donor de electroni sacrificial, iar tert-butaclofenul este utilizat ca inhibitor QB pentru a se asigura că principalul donor RC rămâne redus (adică nu este fotooxidat) pe tot parcursul procesului de măsurare. Aproximativ 3 ml de probă sunt adăugați într-o celulă rotativă personalizată (cu diametrul de aproximativ 0,1 m, 350 RPM) cu o lungime a căii optice de 2 mm pentru a se asigura că proba din calea laserului are suficient timp pentru adaptarea la întuneric între impulsurile de excitație. Se utilizează impulsuri laser de ~100 fs pentru a amplifica sistemul laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, SUA) pentru a excita proba la 880 nm la o rată de repetiție de 1 kHz (20 nJ pentru NIR sau 100 nJ pentru Vis). Înainte de colectarea datelor, expuneți proba la lumină de excitație timp de aproximativ 30 de minute. Expunerea va cauza inactivarea calității de agent (posibil reducând calitatea de agent o dată sau de două ori). Rețineți însă că acest proces este reversibil, deoarece, după o perioadă lungă de adaptare la întuneric, RC va reveni lent la activitatea de agent. Un spectrometru Helios (Ultrafast Systems, SUA) a fost utilizat pentru a măsura spectrele tranzitorii cu un timp de întârziere de la -10 la 7000 ps. Utilizați software-ul Surface Xplorer (Ultrafast Systems, SUA) pentru a degrupa seturile de date, apoi îmbinați-le și standardizați-le. Utilizați pachetul software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) pentru a utiliza setul de date combinat pentru a obține spectre diferențiale legate de descreștere sau utilizați o funcție care convoluează mai mulți exponenți cu răspunsul instrumentului pentru a se potrivi evoluției spectrale pe o singură lungime de undă în Origin (OriginLab, SUA).
Așa cum s-a menționat mai sus (53), a fost preparat un film fotosintetic care conține complexul LH1, lipsit atât de antena RC, cât și de antena periferică LH2. Membrana a fost diluată în 20 mM tris (pH 8,0) și apoi încărcată într-o cuvetă de cuarț cu o cale optică de 2 mm. Un impuls laser de 30 nJ a fost utilizat pentru a excita proba la 540 nm cu un timp de întârziere de la -10 la 7000 ps. Se procesează setul de date așa cum este descris pentru proba Rps.pal.
Membrana a fost peletizată prin centrifugare la 150.000 RCF timp de 2 ore la 4°C, iar apoi absorbanța sa la 880 nm a fost resuspendată în 20 mM tris-HCl (pH 8,0) și 200 mM NaCl. Se dizolvă membrana prin agitare lentă în 2% (g/v) β-DDM timp de 1 oră la întuneric la 4°C. Proba a fost diluată în 100 mM carbonat de trietilamoniu (pH 8,0) (TEAB; Merck, Marea Britanie) până la o concentrație proteică de 2,5 mg ml-1 (analiză Bio-Rad). Prelucrarea ulterioară a fost efectuată conform metodei publicate anterior (54), începând cu diluarea a 50 μg de proteină într-un total de 50 μl TEAB conținând 1% (g/v) laurat de sodiu (Merck, Marea Britanie). După sonicare timp de 60 de secunde, proba a fost redusă cu 5 mM tris(2-carboxietil)fosfină (Merck, Marea Britanie) la 37°C timp de 30 de minute. Pentru S-alchilare, proba se incubează cu 10 mM metil S-metiltiometansulfonat (Merck, Marea Britanie) și se adaugă dintr-o soluție stoc de izopropanol 200 mM timp de 10 minute la temperatura camerei. Digestia proteolitică a fost efectuată prin adăugarea a 2 μg de amestec de tripsină/endoproteinază Lys-C (Promega Marea Britanie) și se incubează la 37°C timp de 3 ore. Surfactantul laurat a fost extras prin adăugarea a 50 μl de acetat de etil și 10 μl de acid trifluoroacetic (TFA; Thermo Fisher Scientific, Marea Britanie) 10% (v/v) de calitate LC și vortexare timp de 60 de secunde. Separarea fazelor a fost promovată prin centrifugare la 15.700 RCF timp de 5 minute. Conform protocolului producătorului, s-a utilizat o coloană de centrifugare C18 (Thermo Fisher Scientific, Marea Britanie) pentru a aspira cu grijă și a desalina faza inferioară care conținea peptida. După uscarea prin centrifugare în vid, proba a fost dizolvată în 0,5% TFA și 3% acetonitril, iar 500 ng au fost analizate prin cromatografie RP în flux nano cuplată cu spectrometrie de masă utilizând parametrii sistemului detaliați anterior.
Folosiți MaxQuant v.1.5.3.30 (56) pentru identificarea și cuantificarea proteinelor pentru a căuta baza de date a proteomilor Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Datele proteomice de spectrometrie de masă au fost depuse în ProteomeXchange Alliance prin intermediul depozitului partener PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sub identificatorul setului de date PXD020402.
Pentru analiza prin RPLC cuplată cu spectrometrie de masă cu ionizare prin electrospray, complexul RC-LH1 a fost preparat din Rps de tip sălbatic. Folosind metoda publicată anterior (16), concentrația de proteine ​​produsă în celulele palustris a fost de 2 mg ml-1 în 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl și 0,03% (g/v) β- (analiză Bio-Rad)) DDM. Conform protocolului producătorului, s-a utilizat un kit de purificare 2D (GE Healthcare, SUA) pentru a extrage 10 μg de proteină prin metoda precipitării și s-a dizolvat precipitatul în 20 μl de acid formic (FA) 60% (v/v), 20% (v/v) acetonitril și 20% (v/v) apă. Cinci microlitri au fost analizați prin RPLC (Dionex RSLC) cuplată cu spectrometrie de masă (Maxis UHR-TOF, Bruker). Se utilizează o coloană MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Marea Britanie) pentru separare la 60°C și 100μlmin-1, cu un gradient de 85% (v/v) solvent A [0,1% (v/v) FA și 0,02% (V/v) soluție apoasă de TFA] la 85% (v/v) solvent B [0,1% (v/v) FA și 0,02% (v/v) în 90% (v/v) acetonitril TFA]. Folosind o sursă standard de ionizare prin electrospray și parametrii impliciți timp de mai mult de 60 de minute, spectrometrul de masă obține o valoare a raportului masă-sarcină de la 100 la 2750 m/z. Cu ajutorul instrumentului FindPept al portalului de resurse bioinformatice ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), se cartografiază spectrul de masă la subunitățile complexului.
Celulele au fost cultivate timp de 72 de ore sub 100 ml de lumină NF cu lumină scăzută (10μMm-2 s-1), medie (30μMm-2 s-1) sau puternică (300μMm-2 s-1). Mediu M22 (mediu M22 în care sulfatul de amoniu este omis și succinatul de sodiu este înlocuit cu acetat de sodiu) într-o sticlă cu dop filetat de 100 ml (23). În cinci cicluri de 30 de secunde, sfere de sticlă de 0,1 microni au fost introduse într-un raport de volum de 1:1 pentru a liza celulele și răcite pe gheață timp de 5 minute. Materia insolubilă, celulele nespărte și sferele de sticlă au fost îndepărtate prin centrifugare la 16.000 RCF timp de 10 minute într-o microcentrifugă de laborator. Membrana a fost separată într-un rotor Ti 70.1 cu 100.000 RCF în tris-HCl 20 mM (pH 8,0) cu un gradient de zaharoză 40/15% (g/g) timp de 10 ore.
Așa cum s-a descris în lucrarea noastră anterioară, imunodetecția etichetei His pe PufW (16). Pe scurt, complexul central purificat (11,8 nM) sau membrana conținând aceeași concentrație de RC (determinată prin oxidare, scăzând spectrul diferențial redus și potrivind încărcătura de pe gelul colorat) în tampon de încărcare 2x SDS (Merck, Marea Britanie) diluat de două ori. Proteinele au fost separate pe un gel replică de 12% bis-tris NuPage (Thermo Fisher Scientific, Marea Britanie). Un gel a fost colorat cu Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Marea Britanie) pentru a încărca și vizualiza subunitatea RC-L. Proteina de pe al doilea gel a fost transferată pe o membrană de fluorură de poliviniliden activată cu metanol (Thermo Fisher Scientific, Marea Britanie) pentru imunotest. Membrana PVDF a fost blocată în 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 și 5% (g/v) lapte praf degresat, apoi incubată cu anticorpul primar anti-His (în tampon diluat cu anticorpi [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl și 0,05% (v/v) Tween-20] în 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, SUA) timp de 4 ore. După spălarea de 3 ori timp de 5 minute în tampon de anticorpi, membrana a fost combinată cu anticorp secundar anti-șoarece cu peroxidază de hrean (Sigma-Aldrich, Marea Britanie) (diluat 1:10.000 în tampon de anticorpi). Se incubează pentru a permite detectarea (5 minute după 3 spălări în tampon de anticorpi) utilizând substratul de chemiluminescență WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) și Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Marea Britanie).
Prin desenarea distribuției intensității fiecărui gel colorat sau bandă de imunotest, integrarea ariei de sub vârf și calcularea raportului de intensitate dintre RC-L (gel colorat) și Protein-W (imunotest), în ImageJ (57) se procesează imaginea. Aceste raporturi au fost convertite în raporturi molare presupunând că raportul dintre RC-L și proteina-W în proba pură RC-LH114-W a fost de 1:1 și normalizând întregul set de date în mod corespunzător.
Pentru materiale suplimentare pentru acest articol, vă rugăm să consultați http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Acesta este un articol cu ​​acces liber, distribuit conform termenilor Licenței Creative Commons Attribution. Articolul permite utilizarea, distribuirea și reproducerea nerestricționate în orice mediu, cu condiția ca lucrarea originală să fie citată corespunzător.
Notă: Vă rugăm doar să ne furnizați adresa dvs. de e-mail, astfel încât persoana pe care o recomandați paginii să știe că doriți ca aceasta să vadă e-mailul și că nu este spam. Nu vom colecta nicio adresă de e-mail.
Această întrebare este folosită pentru a testa dacă sunteți vizitator și pentru a preveni trimiterea automată de spam.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Structura de înaltă rezoluție a complexului capcană de lumină 1 din centrul de reacție oferă noi perspective asupra dinamicii chinonei.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Structura de înaltă rezoluție a complexului capcană de lumină 1 din centrul de reacție oferă noi perspective asupra dinamicii chinonei.
©2021 Asociația Americană pentru Progresul Științei. Toate drepturile rezervate. AAAS este partener al HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef și COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.