Articolul face parte din tema de cercetare „Tehnologii avansate de bioremediere și procese de reciclare a compușilor organici sintetici (SOC)”. Vezi toate cele 14 articole
Hidrocarburile aromatice policiclice (HAP) cu greutate moleculară mică, cum ar fi naftalina și naftalinele substituite (metilnaftalină, acid naftoic, 1-naftil-N-metilcarbamat etc.), sunt utilizate pe scară largă în diverse industrii și sunt genotoxice, mutagene și/sau cancerigene pentru organisme. Acești compuși organici sintetici (SOC) sau xenobiotice sunt considerați poluanți prioritari și reprezintă o amenințare serioasă pentru mediul global și sănătatea publică. Intensitatea activităților umane (de exemplu, gazificarea cărbunelui, rafinarea petrolului, emisiile vehiculelor și aplicațiile agricole) determină concentrația, soarta și transportul acestor compuși omniprezenti și persistenți. Pe lângă metodele de tratare/îndepărtare fizică și chimică, tehnologiile ecologice și ecologice, cum ar fi bioremedierea, care utilizează microorganisme capabile să degradeze complet POC-urile sau să le transforme în subproduse netoxice, au apărut ca o alternativă sigură, rentabilă și promițătoare. Diverse specii bacteriene aparținând încrengăturilor Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia și Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus și Paenibacillus) și Actinobacteria (Rhodococcus și Arthrobacter) din microbiota solului au demonstrat capacitatea de a degrada diverși compuși organici. Studiile metabolice, genomica și analiza metagenomică ne ajută să înțelegem complexitatea și diversitatea catabolică prezente în aceste forme de viață simple, care pot fi aplicate în continuare pentru o biodegradare eficientă. Existența pe termen lung a HAP-urilor a dus la apariția unor noi fenotipuri de degradare prin transfer orizontal de gene folosind elemente genetice precum plasmide, transpozoni, bacteriofagi, insule genomice și elemente conjugative integrative. Biologia sistemelor și ingineria genetică a izolatelor specifice sau a comunităților model (consorții) pot permite bioremedierea cuprinzătoare, rapidă și eficientă a acestor HAP-uri prin efecte sinergice. În această analiză, ne concentrăm pe diferitele căi metabolice și diversitate, compoziția și diversitatea genetică și răspunsurile/adaptările celulare ale bacteriilor care degradează naftalina și naftalina substituită. Acest lucru va oferi informații ecologice pentru aplicații pe teren și optimizarea tulpinilor pentru o bioremediere eficientă.
Dezvoltarea rapidă a industriilor (petrochimice, agricultură, farmaceutice, coloranți textili, cosmetice etc.) a contribuit la prosperitatea economică globală și la îmbunătățirea nivelului de trai. Această dezvoltare exponențială a dus la producerea unui număr mare de compuși organici sintetici (COS), care sunt utilizați pentru fabricarea diverselor produse. Acești compuși străini sau COS includ hidrocarburi aromatice policiclice (HAP), pesticide, erbicide, plastifianți, coloranți, produse farmaceutice, organofosfați, ignifuganți, solvenți organici volatili etc. Aceștia sunt emiși în atmosferă, în ecosistemele acvatice și terestre, unde au impacturi multidimensionale, provocând efecte negative asupra diferitelor bioforme prin alterarea proprietăților fizico-chimice și a structurii comunităților (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Mulți poluanți aromatici au impacturi puternice și distructive asupra multor ecosisteme intacte/puncte fierbinți de biodiversitate (de exemplu, recife de corali, calote glaciare arctice/antarctice, lacuri de munte înalt, sedimente din adâncuri etc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Studii geomicrobiologice recente au arătat că depunerea de materie organică sintetică (de exemplu, poluanți aromatici) și a derivatelor acestora pe suprafețele structurilor artificiale (mediu construit) (de exemplu, situri de patrimoniu cultural și monumente din granit, piatră, lemn și metal) accelerează degradarea acestora (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Activitățile umane pot intensifica și agrava degradarea biologică a monumentelor și clădirilor prin poluarea aerului și schimbările climatice (Liu et al. 2020). Acești contaminanți organici reacționează cu vaporii de apă din atmosferă și se așează pe structură, provocând degradarea fizică și chimică a materialului. Biodegradarea este recunoscută pe scară largă ca fiind modificări nedorite ale aspectului și proprietăților materialelor cauzate de organismele vii, care afectează conservarea acestora (Pochon și Jaton, 1967). Acțiunea microbiană ulterioară (metabolismul) acestor compuși poate reduce integritatea structurală, eficacitatea conservării și valoarea culturală (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Pe de altă parte, în unele cazuri, adaptarea și răspunsul microbian la aceste structuri s-au dovedit a fi benefice, deoarece acestea formează biofilme și alte cruste protectoare care reduc rata de degradare/descompunere (Martino, 2016). Prin urmare, dezvoltarea unor strategii eficiente de conservare durabilă pe termen lung pentru monumentele din piatră, metal și lemn necesită o înțelegere aprofundată a proceselor cheie implicate în acest proces. Comparativ cu procesele naturale (procese geologice, incendii forestiere, erupții vulcanice, reacții la plante și bacterii), activitățile umane duc la eliberarea unor volume mari de hidrocarburi aromatice policiclice (HAP) și alt carbon organic (CO) în ecosisteme. Multe HAP utilizate în agricultură (insecticide și pesticide precum DDT, atrazină, carbaril, pentaclorofenol etc.), industrie (țiței, nămol/deșeuri petroliere, materiale plastice derivate din petrol, PCB-uri, plastifianți, detergenți, dezinfectanți, fumiganți, parfumuri și conservanți), produse de îngrijire personală (creme de protecție solară, dezinfectanți, insecticide și mosc policiclic) și muniții (explozibili precum 2,4,6-TNT) sunt potențiale xenobiotice care pot avea un impact asupra sănătății planetare (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna și Phale, 2008; Petrie și colab., 2015). Această listă poate fi extinsă pentru a include compuși derivați din petrol (păcură, lubrifianți, asfaltene), bioplastice cu greutate moleculară mare și lichide ionice (Amde și colab., 2015). Tabelul 1 enumeră diverși poluanți aromatici și aplicațiile lor în diverse industrii. În ultimii ani, emisiile antropogene de compuși organici volatili, precum și de dioxid de carbon și alte gaze cu efect de seră, au început să crească (Dvorak și colab., 2017). Cu toate acestea, impactul antropogen depășește semnificativ cele naturale. În plus, am constatat că o serie de SOC-uri persistă în multe medii de mediu și au fost identificate ca poluanți emergenți cu efecte adverse asupra biomilor (Figura 1). Agențiile de mediu, cum ar fi Agenția pentru Protecția Mediului din Statele Unite (USEPA), au inclus mulți dintre acești poluanți în lista lor de priorități datorită proprietăților lor citotoxice, genotoxice, mutagene și cancerigene. Prin urmare, sunt necesare reglementări stricte privind eliminarea și strategii eficiente pentru tratarea/îndepărtarea deșeurilor din ecosistemele contaminate. Diverse metode de tratare fizică și chimică, cum ar fi piroliza, tratamentul termic oxidativ, aerarea aerului, depozitarea deșeurilor, incinerarea etc., sunt ineficiente și costisitoare și generează subproduse corozive, toxice și dificil de tratat. Odată cu creșterea gradului de conștientizare globală a mediului, microorganismele capabile să degradeze acești poluanți și derivații acestora (cum ar fi halogenați, nitro, alchil și/sau metil) atrag o atenție tot mai mare (Fennell et al., 2004; Haritash și Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Utilizarea acestor microorganisme candidate indigene, singure sau în culturi mixte (colonii), pentru eliminarea poluanților aromatici prezintă avantaje în ceea ce privește siguranța mediului, costul, eficiența, eficacitatea și sustenabilitatea. Cercetătorii explorează, de asemenea, integrarea proceselor microbiene cu metode redox electrochimice, și anume sistemele bioelectrochimice (BES), ca tehnologie promițătoare pentru tratarea/eliminarea poluanților (Huang et al., 2011). Tehnologia BES a atras o atenție tot mai mare datorită eficienței sale ridicate, costului redus, siguranței mediului, funcționării la temperatura camerei, materialelor biocompatibile și capacității de a recupera subproduse valoroase (de exemplu, electricitate, combustibil și substanțe chimice) (Pant și colab., 2012; Nazari și colab., 2020). Apariția secvențierii genomului de mare randament și a instrumentelor/metodelor omice a furnizat o multitudine de informații noi despre reglarea genetică, proteomica și fluxomica reacțiilor diferitelor microorganisme degradante. Combinarea acestor instrumente cu biologia sistemelor ne-a îmbunătățit și mai mult înțelegerea selecției și reglării fine a căilor catabolice țintă în microorganisme (adică, proiectarea metabolică) pentru a obține o biodegradare eficientă și efectivă. Pentru a proiecta strategii eficiente de bioremediere utilizând microorganisme candidate adecvate, trebuie să înțelegem potențialul biochimic, diversitatea metabolică, compoziția genetică și ecologia (autoecologia/sinecologia) microorganismelor.
Fig. 1. Surse și căi ale HAP-urilor cu greutate moleculară mică prin diverse medii de mediu și diverși factori care afectează biota. Liniile punctate reprezintă interacțiunile dintre elementele ecosistemului.
În această analiză, am încercat să rezumăm datele privind degradarea HAP-urilor simple, cum ar fi naftalina și naftalinele substituite, de către diverse izolate bacteriene, acoperind căile metabolice și diversitatea, enzimele implicate în degradare, compoziția/conținutul și diversitatea genelor, răspunsurile celulare și diverse aspecte ale bioremedierii. Înțelegerea nivelurilor biochimice și moleculare va ajuta la identificarea tulpinilor gazdă adecvate și a ingineriei genetice ulterioare pentru bioremedierea eficientă a acestor poluanți prioritari. Acest lucru va ajuta la dezvoltarea de strategii pentru stabilirea unor consorții bacteriene specifice amplasamentului pentru o bioremediere eficientă.
Prezența unui număr mare de compuși aromatici toxici și periculoși (care satisfac regula lui Huckel 4n + 2π electroni, n = 1, 2, 3, …) reprezintă o amenințare serioasă pentru diverse medii de mediu, cum ar fi aerul, solul, sedimentele și apele de suprafață și subterane (Puglisi et al., 2007). Acești compuși au inele benzenice simple (monociclice) sau inele benzenice multiple (policiclice) aranjate în formă liniară, unghiulară sau de cluster și prezintă stabilitate (stabilitate/instabilitate) în mediu datorită energiei de rezonanță negativă ridicată și inerției (inerției), care poate fi explicată prin hidrofobicitatea și starea lor redusă. Atunci când inelul aromatic este înlocuit în continuare cu grupări metil (-CH3), carboxil (-COOH), hidroxil (-OH) sau sulfonat (-HSO3), acesta devine mai stabil, are o afinitate mai puternică pentru macromolecule și este bioacumulativ în sistemele biologice (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Unele hidrocarburi aromatice policiclice cu greutate moleculară mică (LMWAH), cum ar fi naftalina și derivații acesteia [metilnaftalină, acid naftoic, naftalensulfonat și 1-naftil N-metilcarbamat (carbaril)], au fost incluse în lista poluanților organici prioritari de către Agenția pentru Protecția Mediului din SUA ca fiind genotoxice, mutagene și/sau cancerigene (Cerniglia, 1984). Eliberarea acestei clase de NM-HAP în mediu poate duce la bioacumularea acestor compuși la toate nivelurile lanțului trofic, afectând astfel sănătatea ecosistemelor (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Sursele și căile de acces ale HAP-urilor către biotă se manifestă în principal prin migrație și interacțiuni dintre diferite componente ale ecosistemului, cum ar fi solul, apele subterane, apele de suprafață, culturile și atmosfera (Arey și Atkinson, 2003). Figura 1 prezintă interacțiunile și distribuția diferitelor HAP-uri cu greutate moleculară mică în ecosisteme și căile lor către expunerea la biotă/om. HAP-urile se depun pe suprafețe ca urmare a poluării aerului și prin migrarea (drive-ul) emisiilor vehiculelor, gazelor de eșapament industriale (gazificarea cărbunelui, arderea și producția de cocs) și depunerea acestora. Activități industriale precum fabricarea de textile sintetice, coloranți și vopsele; conservarea lemnului; prelucrarea cauciucului; activitățile de fabricare a cimentului; producția de pesticide; și aplicațiile agricole sunt surse majore de HAP-uri în sistemele terestre și acvatice (Bamforth și Singleton, 2005; Wick și colab., 2011). Studiile au arătat că solurile din zonele suburbane și urbane, din apropierea autostrăzilor și din orașele mari sunt mai susceptibile la hidrocarburile aromatice policiclice (HAP) din cauza emisiilor provenite de la centralele electrice, încălzirea rezidențială, traficul aerian și rutier și activitățile de construcții (Suman et al., 2016). (2008) a arătat că HAP-urile din solul din apropierea drumurilor din New Orleans, Louisiana, SUA, au atins valori de până la 7189 μg/kg, în timp ce în spațiul deschis, acestea au fost de doar 2404 μg/kg. În mod similar, niveluri de HAP de până la 300 μg/kg au fost raportate în zonele din apropierea siturilor de gazificare a cărbunelui din mai multe orașe din SUA (Kanaly și Harayama, 2000; Bamforth și Singleton, 2005). Solurile din diverse orașe indiene, cum ar fi Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni și Venkataraman, 2000) și Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014), au fost raportate ca conținând concentrații mari de HAP. Compușii aromatici sunt mai ușor adsorbiți pe particulele de sol, materia organică și mineralele argiloase, devenind astfel absorbanți majori de carbon în ecosisteme (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Principalele surse de HAP în ecosistemele acvatice sunt precipitațiile (precipitații umede/uscate și vapori de apă), scurgerile urbane, deversarea apelor uzate, reîncărcarea apelor subterane etc. (Srogi, 2007). Se estimează că aproximativ 80% din HAP-urile din ecosistemele marine provin din precipitații, sedimentare și deversarea deșeurilor (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Concentrațiile mai mari de HAP din apele de suprafață sau din levigatul provenit de la depozitele de deșeuri solide se scurg în cele din urmă în pânzele subterane, reprezentând o amenințare majoră pentru sănătatea publică, deoarece peste 70% din populația Asiei de Sud și de Sud-Est consumă ape subterane (Duttagupta și colab., 2019). Un studiu recent realizat de Duttagupta și colab. (2020) asupra analizelor râurilor (32) și subterane (235) din Bengalul de Vest, India, a constatat că aproximativ 53% dintre locuitorii urbani și 44% dintre locuitorii rurali (în total 20 de milioane de locuitori) pot fi expuși la naftalină (4,9–10,6 μg/L) și derivații acesteia. Modelele diferențiate de utilizare a terenurilor și extracția crescută a apelor subterane sunt considerate a fi principalii factori care controlează transportul vertical (advecția) HAP cu greutate moleculară mică în subsol. S-a constatat că scurgerile agricole, deversările de ape uzate municipale și industriale și deșeurile solide/gunoiul sunt afectate de HAP în bazinele hidrografice și în sedimentele subterane. Precipitațiile atmosferice agravează și mai mult poluarea cu HAP. Concentrații mari de HAP și derivați alchilici ai acestora (51 în total) au fost raportate în râuri/bazine hidrografice din întreaga lume, cum ar fi râurile Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro și Delaware (Yunker și colab., 2002; Motelay-Massei și colab., 2006; Li și colab., 2010; Amoako și colab., 2011; Kim și colab., 2018). În sedimentele bazinului râului Gange, naftalina și fenantrenul s-au dovedit a fi cele mai semnificative (detectate în 70% din probe) (Duttagupta și colab., 2019). Mai mult, studiile au arătat că clorurarea apei potabile poate duce la formarea unor HAP oxigenate și clorurate mai toxice (Manoli și Samara, 1999). HAP-urile se acumulează în cereale, fructe și legume ca urmare a absorbției de către plante din solurile contaminate, apele subterane și precipitații (Fismes et al., 2002). Multe organisme acvatice, cum ar fi peștii, midiile, scoicile și creveții, sunt contaminate cu HAP-uri prin consumul de alimente și apă de mare contaminate, precum și prin țesuturi și piele (Mackay și Fraser, 2000). Metodele de gătire/procesare, cum ar fi grătarul, prăjirea, afumarea, prăjirea, uscarea, coacerea și gătitul pe cărbune, pot duce, de asemenea, la cantități semnificative de HAP-uri în alimente. Acest lucru depinde în mare măsură de alegerea materialului de afumare, conținutul de hidrocarburi fenolice/aromatice, procedura de gătire, tipul de încălzitor, conținutul de umiditate, aportul de oxigen și temperatura de ardere (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Hidrocarburile aromatice policiclice (HAP) au fost, de asemenea, detectate în lapte în concentrații variabile (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Acumularea acestor HAP în alimente depinde și de proprietățile fizico-chimice ale alimentelor, în timp ce efectele lor toxice sunt legate de funcțiile fiziologice, activitatea metabolică, absorbția, distribuția și distribuția în organism (Mechini și colab., 2011).
Toxicitatea și efectele nocive ale hidrocarburilor aromatice policiclice (HAP) sunt cunoscute de mult timp (Cherniglia, 1984). Hidrocarburile aromatice policiclice cu greutate moleculară mică (HAP-LMW) (două până la trei inele) se pot lega covalent de diverse macromolecule precum ADN, ARN și proteine ​​și sunt cancerigene (Santarelli et al., 2008). Datorită naturii lor hidrofobe, acestea sunt separate prin membrane lipidice. La om, monooxigenazele citocromului P450 oxidează HAP-urile în epoxizi, dintre care unii sunt foarte reactivi (de exemplu, epoxidul de baediol) și pot duce la transformarea celulelor normale în maligne (Marston et al., 2001). În plus, produșii de transformare a HAP-urilor, cum ar fi chinonele, fenolii, epoxizii, diolii etc., sunt mai toxici decât compușii inițiali. Unele HAP și intermediarii lor metabolici pot afecta hormonii și diverse enzime din metabolism, afectând astfel negativ creșterea, sistemul nervos central, sistemul reproducător și sistemul imunitar (Swetha și Phale, 2005; Vamsee-Krishna și colab., 2006; Oostingh și colab., 2008). S-a raportat că expunerea pe termen scurt la HAP cu greutate moleculară mică provoacă afectarea funcției pulmonare și tromboză la astmatici și crește riscul de cancer de piele, plămâni, vezică urinară și gastrointestinal (Olsson și colab., 2010; Diggs și colab., 2011). Studiile pe animale au arătat, de asemenea, că expunerea la HAP poate avea efecte adverse asupra funcției reproductive și a dezvoltării și poate provoca cataractă, leziuni renale și hepatice și icter. S-a demonstrat că diverși produși de biotransformare a HAP, cum ar fi diolii, epoxizii, chinonele și radicalii liberi (cationii), formează aducți de ADN. S-a demonstrat că aductii stabili modifică mecanismul de replicare a ADN-ului, în timp ce aductii instabili pot depurina ADN-ul (în principal la adenină și uneori la guanină); ambele pot genera erori care duc la mutații (Schweigert et al. 2001). În plus, chinonele (benzo-/pan-) pot genera specii reactive de oxigen (ROS), provocând leziuni fatale ADN-ului și altor macromolecule, afectând astfel funcția/viabilitatea țesuturilor (Ewa și Danuta 2017). S-a raportat că expunerea cronică la concentrații scăzute de piren, bifenil și naftalină provoacă cancer la animalele de experiment (Diggs et al. 2012). Datorită toxicității lor letale, curățarea/îndepărtarea acestor HAP-uri din locurile afectate/contaminate este o prioritate.
Diverse metode fizice și chimice au fost utilizate pentru a elimina HAP-urile din siturile/mediile contaminate. Procese precum incinerarea, declorinarea, oxidarea UV, fixarea și extracția cu solvent prezintă numeroase dezavantaje, inclusiv formarea de subproduse toxice, complexitatea procesului, probleme de siguranță și reglementare, eficiență scăzută și cost ridicat. Cu toate acestea, biodegradarea microbiană (numită bioremediere) este o abordare alternativă promițătoare care implică utilizarea microorganismelor sub formă de culturi pure sau colonii. Comparativ cu metodele fizice și chimice, acest proces este ecologic, neinvaziv, rentabil și sustenabil. Bioremedierea poate fi efectuată la locul afectat (in situ) sau la un loc special pregătit (ex situ) și, prin urmare, este considerată o metodă de remediere mai sustenabilă decât metodele fizice și chimice tradiționale (Juhasz și Naidu, 2000; Andreoni și Gianfreda, 2007; Megharaj și colab., 2011; Phale și colab., 2020; Sarkar și colab., 2020).
Înțelegerea etapelor metabolice microbiene implicate în degradarea poluanților aromatici are implicații științifice și economice enorme pentru sustenabilitatea ecologică și de mediu. Se estimează că 2,1 × 1018 grame de carbon (C) sunt stocate în sedimente și compuși organici (adică petrol, gaze naturale și cărbune, adică combustibili fosili) la nivel mondial, contribuind semnificativ la ciclul global al carbonului. Cu toate acestea, industrializarea rapidă, extracția combustibililor fosili și activitățile umane epuizează aceste rezervoare litosferice de carbon, eliberând anual în atmosferă aproximativ 5,5 × 1015 g de carbon organic (sub formă de poluanți) (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Cea mai mare parte a acestui carbon organic pătrunde în ecosistemele terestre și marine prin sedimentare, transport și scurgeri. În plus, noii poluanți sintetici derivați din combustibili fosili, cum ar fi materialele plastice, plastifianții și stabilizatorii din plastic (ftalații și izomerii acestora), poluează grav ecosistemele marine, solului și acvatice, precum și biota acestora, exacerbând astfel riscurile climatice globale. Diverse tipuri de microplastice, nanoplastice, fragmente de plastic și produsele lor monomerice toxice derivate din tereftalat de polietilenă (PET) s-au acumulat în Oceanul Pacific, între America de Nord și Asia de Sud-Est, formând „Marele Petic de Gunoi din Pacific”, dăunând vieții marine (Newell et al., 2020). Studiile științifice au dovedit că nu este posibilă eliminarea acestor poluanți/deșeuri prin metode fizice sau chimice. În acest context, cele mai utile microorganisme sunt cele capabile să metabolizeze oxidativ poluanții în dioxid de carbon, energie chimică și alte produse secundare netoxice care, în cele din urmă, intră în alte procese ale ciclului nutrienților (H2, O, N, S, P, Fe etc.). Astfel, înțelegerea ecofiziologiei microbiene a mineralizării poluanților aromatici și a controlului acesteia în mediu este crucială pentru evaluarea ciclului carbonului microbian, a bugetului net de carbon și a riscurilor climatice viitoare. Având în vedere nevoia urgentă de a elimina astfel de compuși din mediu, au apărut diverse eco-industrii axate pe tehnologii curate. Alternativ, valorificarea deșeurilor industriale/substanțelor chimice reziduale acumulate în ecosisteme (adică abordarea de tip „deșeuri în bogăție”) este considerată unul dintre pilonii economiei circulare și ai obiectivelor de dezvoltare durabilă (Close et al., 2012). Prin urmare, înțelegerea aspectelor metabolice, enzimatice și genetice ale acestor potențiali candidați la degradare este de o importanță capitală pentru eliminarea și bioremedierea eficientă a acestor poluanți aromatici.
Printre numeroșii poluanți aromatici, acordăm o atenție deosebită HAP-urilor cu greutate moleculară mică, cum ar fi naftalina și naftalinele substituite. Acești compuși sunt componente majore ale combustibililor derivați din petrol, coloranților textili, produselor de consum, pesticidelor (naftalină și repelenți de insecte), plastifianților și taninurilor și, prin urmare, sunt răspândiți în multe ecosisteme (Preuss et al., 2003). Rapoarte recente evidențiază acumularea concentrațiilor de naftalină în sedimentele acvifere, apele subterane și solurile subterane, zonele vadoase și albiile râurilor, sugerând bioacumularea acesteia în mediu (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabelul 2 prezintă un rezumat al proprietăților fizico-chimice, aplicațiilor și efectelor asupra sănătății ale naftalinei și derivaților săi. Comparativ cu alte HAP-uri cu greutate moleculară mare, naftalina și derivații săi sunt mai puțin hidrofobi, mai solubili în apă și distribuiți pe scară largă în ecosisteme, astfel încât sunt adesea utilizați ca substraturi model pentru a studia metabolismul, genetica și diversitatea metabolică a HAP-urilor. Un număr mare de microorganisme sunt capabile să metabolizeze naftalina și derivații acesteia, iar informații complete sunt disponibile despre căile metabolice, enzime și caracteristicile lor de reglare (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). În plus, naftalina și derivații acesteia sunt desemnați drept compuși prototip pentru evaluarea poluării mediului datorită abundenței și biodisponibilității lor ridicate. Agenția pentru Protecția Mediului din SUA estimează că nivelurile medii de naftalină sunt de 5,19 μg pe metru cub din fumul de țigară, în principal din arderea incompletă, și de 7,8 până la 46 μg din fumul lateral, în timp ce expunerea la creozot și naftalină este de 100 până la 10.000 de ori mai mare (Preuss et al. 2003). S-a constatat că naftalina, în special, are toxicitate respiratorie și carcinogenitate specifice speciei, regiunii și sexului. Pe baza studiilor pe animale, Agenția Internațională pentru Cercetarea Cancerului (IARC) a clasificat naftalina drept „posibil cancerigen uman” (Grupa 2B)1. Expunerea la naftaline substituite, în principal prin inhalare sau administrare parenterală (orală), provoacă leziuni ale țesutului pulmonar și crește incidența tumorilor pulmonare la șobolani și șoareci (Programul Național de Toxicologie 2). Efectele acute includ greață, vărsături, dureri abdominale, diaree, dureri de cap, confuzie, transpirații abundente, febră, tahicardie etc. Pe de altă parte, insecticidul carbamat cu spectru larg carbaril (1-naftil N-metilcarbamat) a fost raportat ca fiind toxic pentru nevertebratele acvatice, amfibieni, albine melifere și oameni și s-a demonstrat că inhibă acetilcolinesteraza, provocând paralizie (Smulders et al., 2003; Bulen și Distel, 2011). Prin urmare, înțelegerea mecanismelor de degradare microbiană, a reglării genetice, a reacțiilor enzimatice și celulare este crucială pentru dezvoltarea strategiilor de bioremediere în mediile contaminate.
Tabelul 2. Informații detaliate privind proprietățile fizico-chimice, utilizările, metodele de identificare și bolile asociate ale naftalinei și derivaților acesteia.
În nișele poluate, poluanții aromatici hidrofobi și lipofilici pot provoca o varietate de efecte celulare asupra microbiomului (comunității) din mediu, cum ar fi modificări ale fluidității membranei, permeabilității membranei, umflarea stratului lipidic dublu, perturbarea transferului de energie (lanțul de transport al electronilor/forța motrice a protonilor) și activitatea proteinelor asociate membranei (Sikkema et al., 1995). În plus, unii intermediari solubili, cum ar fi catecolii și chinonele, generează specii reactive de oxigen (ROS) și formează aducți cu ADN și proteine ​​(Penning et al., 1999). Astfel, abundența acestor compuși în ecosisteme exercită o presiune selectivă asupra comunităților microbiene pentru a deveni degradanți eficienți la diferite niveluri fiziologice, inclusiv absorbția/transportul, transformarea intracelulară, asimilarea/utilizarea și compartimentarea.
O căutare în cadrul Ribosomal Database Project-II (RDP-II) a relevat că un total de 926 de specii bacteriene au fost izolate din medii sau culturi de îmbogățire contaminate cu naftalină sau derivați ai acesteia. Grupul Proteobacteria a avut cel mai mare număr de reprezentanți (n = 755), urmat de Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) și bacterii neclasificate (8) (Figura 2). Reprezentanții γ-Proteobacteria (Pseudomonadales și Xanthomonadales) au dominat toate grupurile Gram-negative cu conținut ridicat de G+C (54%), în timp ce Clostridiales și Bacillales (30%) au fost grupuri Gram-pozitive cu conținut scăzut de G+C. S-a raportat că Pseudomonas (cel mai mare număr, 338 de specii) poate degrada naftalina și derivații săi metilici în diverse ecosisteme poluate (gudron de cărbune, petrol, țiței, nămol, deversări de petrol, ape uzate, deșeuri organice și depozite de deșeuri), precum și în ecosisteme intacte (sol, râuri, sedimente și ape subterane) (Figura 2). Mai mult, studiile de îmbogățire și analiza metagenomică a unora dintre aceste regiuni au relevat că speciile de Legionella și Clostridium necultivate pot avea capacitate de degradare, indicând necesitatea cultivării acestor bacterii pentru a studia noi căi și diversitatea metabolică.
Fig. 2. Diversitatea taxonomică și distribuția ecologică a reprezentanților bacterieni în medii contaminate cu naftalină și derivați de naftalină.
Printre diversele microorganisme care degradează hidrocarburile aromatice, majoritatea sunt capabile să degradeze naftalina ca unică sursă de carbon și energie. Secvența evenimentelor implicate în metabolismul naftalinei a fost descrisă pentru Pseudomonas sp. (tulpini: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 și CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 și alte tulpini (ND6 și AS1) (Mahajan și colab., 1994; Resnick și colab., 1996; Annweiler și colab., 2000; Basu și colab., 2003; Dennis și Zylstra, 2004; Sota și colab., 2006; Metabolismul este inițiat de o dioxigenază multicomponentă [naftalen dioxigenază (NDO), o dioxigenază hidroxilantă a inelului] care catalizează oxidarea unuia dintre inelele aromatice ale naftalinei folosind oxigen molecular ca celălalt substrat, transformând naftalina în cis-naftalindiol (Figura 3). Cis-dihidrodiolul este convertit în 1,2-dihidroxinaftalină de către o dehidrogenază. A Dioxigenaza care scindează inelul, 1,2-dihidroxinaftalen dioxigenaza (12DHNDO), transformă 1,2-dihidroxinaftalenul în acid 2-hidroxicromen-2-carboxilic. Izomerizarea enzimatică cis-trans produce trans-o-hidroxibenzilidenpiruvat, care este scindat de aldolază hidratază în aldehidă salicilă și piruvat. Piruvatul acid organic a fost primul compus C3 derivat din scheletul de carbon al naftalinei și direcționat în calea centrală a carbonului. În plus, salicilaldehida dehidrogenaza dependentă de NAD+ transformă salicilaldehida în acid salicilic. Metabolismul în această etapă se numește „calea superioară” a degradării naftalinei. Această cale este foarte frecventă la majoritatea bacteriilor care degradează naftalina. Cu toate acestea, există câteva excepții; de exemplu, în Bacillus hamburgii 2 termofil, degradarea naftalinei este inițiată de naftalen 2,3-dioxigenază pentru a forma 2,3-dihidroxinaftalenă (Annweiler și colab., 2000).
Figura 3. Căile de degradare a naftalinei, metilnaftalinei, acidului naftoic și carbarilului. Numerele încercuite reprezintă enzimele responsabile pentru conversia secvențială a naftalinei și a derivaților săi în produse ulterioare. 1 — naftalen dioxigenază (NDO); 2, cis-dihidrodiol dehidrogenază; 3, 1,2-dihidroxinaftalen dioxigenază; 4, izomerază a acidului 2-hidroxicromen-2-carboxilic; 5, trans-O-hidroxibenzilidenpiruvat hidratază aldolază; 6, salicilaldehidă dehidrogenază; 7, salicilat 1-hidroxilază; 8, catecol 2,3-dioxigenază (C23DO); 9, 2-hidroximuconat semialdehidă dehidrogenază; 10, 2-oxopent-4-enoat hidratază; 11, 4-hidroxi-2-oxopentanoat aldolază; 12, acetaldehidă dehidrogenază; 13, catecol-1,2-dioxigenază (C12DO); 14, muconat cicloizomerază; 15, muconolactonă delta-izomerază; 16, β-cetoadipatenolactonă hidrolază; 17, β-cetoadipat succinil-CoA transferază; 18, β-cetoadipat-CoA tiolază; 19, succinil-CoA: acetil-CoA succiniltransferază; 20, salicilat 5-hidroxilază; 21 – gentisat 1,2-dioxigenază (GDO); 22, maleilpiruvat izomerază; 23, fumarilpiruvat hidrolază; 24, metilnaftalen hidroxilază (NDO); 25, hidroximetilnaftalen dehidrogenază; 26, naftalaldehidă dehidrogenază; 27, oxidază a acidului 3-formilsalicilic; 28, hidroxiizoftalat decarboxilază; 29, carbaril hidrolază (CH); 30, 1-naftol-2-hidroxilază.
În funcție de organism și de structura sa genetică, acidul salicilic rezultat este metabolizat în continuare fie prin calea catecolului folosind salicilat 1-hidroxilază (S1H), fie prin calea gentisatului folosind salicilat 5-hidroxilază (S5H) (Figura 3). Deoarece acidul salicilic este principalul intermediar în metabolismul naftalinei (calea superioară), etapele de la acidul salicilic la intermediarul TCA sunt adesea denumite calea inferioară, iar genele sunt organizate într-un singur operon. Este obișnuit să se observe că genele din operonul căii superioare (nah) și operonul căii inferioare (sal) sunt reglate de factori de reglare comuni; de exemplu, NahR și acidul salicilic acționează ca inductori, permițând ambilor operoni să metabolizeze complet naftalina (Phale et al., 2019, 2020).
În plus, catecolul este scindat ciclic în 2-hidroximuconat semialdehidă prin calea meta de către catecol 2,3-dioxigenază (C23DO) (Yen și colab., 1988) și hidrolizat în continuare de 2-hidroximuconat semialdehidă hidrolază pentru a forma acid 2-hidroxipent-2,4-dienoic. 2-hidroxipent-2,4-dienoatul este apoi convertit în piruvat și acetaldehidă de către o hidrază (2-oxopent-4-enoat hidrază) și o aldază (4-hidroxi-2-oxopentanoat aldază) și apoi intră pe calea centrală a carbonului (Figura 3). Alternativ, catecolul este scindat ciclic în cis,cis-muconat prin calea orto de către catecol 1,2-oxigenază (C12DO). Muconat cicloizomeraza, muconolacton izomeraza și β-cetoadipat-nolacton hidrolaza transformă cis,cis-muconatul în 3-oxoadipat, care intră în calea centrală a carbonului prin succinil-CoA și acetil-CoA (Nozaki și colab., 1968) (Figura 3).
În calea gentisatului (2,5-dihidroxibenzoat), inelul aromatic este scindat de gentisat 1,2-dioxigenaza (GDO) pentru a forma maleilpiruvat. Acest produs poate fi hidrolizat direct în piruvat și malat sau poate fi izomerizat pentru a forma fumarilpiruvat, care poate fi apoi hidrolizat în piruvat și fumarat (Larkin și Day, 1986). Alegerea căii alternative a fost observată atât la bacteriile Gram-negative, cât și la cele Gram-pozitive, la nivel biochimic și genetic (Morawski și colab., 1997; Whyte și colab., 1997). Bacteriile Gram-negative (Pseudomonas) preferă să utilizeze acidul salicilic, care este un inductor al metabolismului naftalinei, decarboxilându-l în catecol folosind salicilat 1-hidroxilază (Gibson și Subramanian, 1984). Pe de altă parte, la bacteriile Gram-pozitive (Rhodococcus), salicilat 5-hidroxilaza transformă acidul salicilic în acid gentisic, în timp ce acidul salicilic nu are niciun efect inductiv asupra transcripției genelor naftalenei (Grund și colab., 1992) (Figura 3).
S-a raportat că specii precum Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, speciile de Pseudomonas și Mycobacterium pot degrada monometilnaftalina sau dimetilnaftalina (Dean-Raymond și Bartha, 1975; Cane și Williams, 1982; Mahajan și colab., 1994; Dutta și colab., 1998; Hedlund și colab., 1999). Printre acestea, calea de degradare a 1-metilnaftalinei și 2-metilnaftalinei de către Pseudomonas sp. CSV86 a fost studiată în mod clar la nivel biochimic și enzimatic (Mahajan și colab., 1994). 1-Metilnaftalina este metabolizată prin două căi. Mai întâi, inelul aromatic este hidroxilat (inelul nesubstituit al metilnaftalinei) pentru a forma cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-8-metilnaftalină, care este oxidată în continuare la salicilat de metil și metilcatecol, apoi intră în calea centrală a carbonului după scindarea ciclului (Figura 3). Această cale se numește „calea sursei de carbon”. În a doua „cale de detoxifiere”, gruparea metil poate fi hidroxilată de NDO pentru a forma 1-hidroximetilnaftalină, care este oxidată în continuare la acid 1-naftoic și excretată în mediul de cultură ca produs fără ieșire. Studiile au arătat că tulpina CSV86 nu este capabilă să crească pe acid 1- și 2-naftoic ca unică sursă de carbon și energie, confirmând calea sa de detoxifiere (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). În 2-metilnaftalină, gruparea metil suferă o hidroxilare de către hidroxilază pentru a forma 2-hidroximetilnaftalină. În plus, inelul nesubstituit al inelului naftalinic suferă o hidroxilare a inelului pentru a forma un dihidrodiol, care este oxidat la 4-hidroximetilcatecol într-o serie de reacții catalizate de enzime și intră în calea centrală a carbonului prin calea de scindare a meta-inelului. În mod similar, s-a raportat că S. paucimobilis 2322 utilizează NDO pentru a hidroxila 2-metilnaftalină, care este oxidată în continuare pentru a forma salicilat de metil și metilcatecol (Dutta et al., 1998).
Acizii naftoici (substituiți/nesubstituiți) sunt produse secundare de detoxifiere/biotransformare formate în timpul degradării metilnaftalinei, fenantrenului și antracenului și eliberate în mediul de cultură utilizat. S-a raportat că izolatul de sol Stenotrophomonas maltophilia CSV89 este capabil să metabolizeze acidul 1-naftoic ca sursă de carbon (Phale et al., 1995). Metabolismul începe cu dihidroxilarea inelului aromatic pentru a forma 1,2-dihidroxi-8-carboxinaftalină. Diolul rezultat este oxidat în catecol prin intermediul 2-hidroxi-3-carboxibenzilidenpiruvatului, acidului 3-formilsalicilic, acidului 2-hidroxiizoftalic și acidului salicilic și intră în calea centrală a carbonului prin calea de scindare a inelului meta (Figura 3).
Carbarilul este un pesticid pe bază de carbamat de naftil. De la Revoluția Verde din India, în anii 1970, utilizarea îngrășămintelor și pesticidelor chimice a dus la o creștere a emisiilor de hidrocarburi aromatice policiclice (HAP) din surse agricole non-punctuale (Pingali, 2012; Duttagupta și colab., 2020). Se estimează că 55% (85.722.000 de hectare) din terenurile cultivate totale din India sunt tratate cu pesticide chimice. În ultimii cinci ani (2015-2020), sectorul agricol indian a utilizat în medie între 55.000 și 60.000 de tone de pesticide anual (Departamentul Cooperativelor și Bunăstării Fermierilor, Ministerul Agriculturii, Guvernul Indiei, august 2020). În câmpiile Gangelui de nord și central (statele cu cea mai mare densitate a populației), utilizarea pesticidelor pe culturi este răspândită, predominând insecticidele. Carbarilul (1-naftil-N-metilcarbamatul) este un insecticid carbamat cu spectru larg, cu toxicitate moderată până la foarte mare, utilizat în agricultura indiană într-o cantitate medie de 100-110 tone. Este vândut în mod obișnuit sub denumirea comercială Sevin și este utilizat pentru combaterea insectelor (afide, furnici de foc, purici, acarieni, păianjeni și mulți alți dăunători din exterior) care afectează o varietate de culturi (porumb, soia, bumbac, fructe și legume). Unele microorganisme precum Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus și Arthrobacter pot fi, de asemenea, utilizate pentru combaterea altor dăunători. S-a raportat că RC100 poate degrada carbarilul (Larkin și Day, 1986; Chapalamadugu și Chaudhry, 1991; Hayatsu și colab., 1999; Swetha și Phale, 2005; Trivedi și colab., 2017). Calea de degradare a carbarilului a fost studiată pe larg la nivel biochimic, enzimatic și genetic în izolate de sol de Pseudomonas sp. Tulpinile C4, C5 și C6 (Swetha și Phale, 2005; Trivedi și colab., 2016) (Fig. 3). Calea metabolică începe cu hidroliza legăturii esterice de către carbaril hidrolază (CH4) pentru a forma 1-naftol, metilamină și dioxid de carbon. 1-naftolul este apoi convertit în 1,2-dihidroxinaftalină de către 1-naftol hidroxilaza (1-NH), care este metabolizată în continuare prin calea centrală a carbonului prin salicilat și gentisat. S-a raportat că unele bacterii care degradează carbarilul îl metabolizează în acid salicilic prin scindarea inelului orto catecol (Larkin și Day, 1986; Chapalamadugu și Chaudhry, 1991). În special, bacteriile care degradează naftalina metabolizează în principal acidul salicilic prin catecol, în timp ce bacteriile care degradează carbarilul preferă să metabolizeze acidul salicilic prin calea gentisatului.
Acidul naftalensulfonic/acidul disulfonic și derivații acidului naftilaminsulfonic pot fi utilizați ca intermediari în producerea de coloranți azoici, agenți de umectare, dispersanți etc. Deși acești compuși au o toxicitate scăzută pentru oameni, evaluările citotoxicității au arătat că sunt letali pentru pești, dafnie și alge (Greim și colab., 1994). S-a raportat că reprezentanții genului Pseudomonas (tulpinile A3, C22) inițiază metabolismul prin dubla hidroxilare a inelului aromatic care conține gruparea acidului sulfonic pentru a forma un dihidrodiol, care este convertit în continuare în 1,2-dihidroxinaftalină prin scindarea spontană a grupării sulfit (Brilon și colab., 1981). 1,2-dihidroxinaftalina rezultată este catabolizată prin calea clasică a naftalinei, adică calea catecholului sau gentisatului (Figura 4). S-a demonstrat că acidul aminonaftalensulfonic și acidul hidroxinaftalensulfonic pot fi complet degradate de consorții bacteriene mixte cu căi catabolice complementare (Nortemann și colab., 1986). S-a demonstrat că un membru al consorțiului desulfurizează acidul aminonaftalensulfonic sau acidul hidroxinaftalensulfonic prin 1,2-dioxigenare, în timp ce aminosalicilatul sau hidroxialicilatul este eliberat în mediul de cultură ca metabolit fără ieșire și este ulterior absorbit de alți membri ai consorțiului. Acidul naftalensulfonic este relativ polar, dar slab biodegradabil și, prin urmare, poate fi metabolizat prin diferite căi. Prima desulfurare are loc în timpul dihidroxilării regioselective a inelului aromatic și a grupării acidului sulfonic; a doua desulfurare are loc în timpul hidroxilării acidului 5-sulfosalicilic de către 5-hidroxilaza acidului salicilic pentru a forma acid gentisic, care intră pe calea centrală a carbonului (Brilon și colab., 1981) (Figura 4). Enzimele responsabile de degradarea naftalinei sunt responsabile și de metabolismul sulfonatului de naftalen (Brilon și colab., 1981; Keck și colab., 2006).
Figura 4. Căi metabolice pentru degradarea naftalen sulfonatului. Numerele din interiorul cercurilor reprezintă enzimele responsabile de metabolismul naftilsulfonatului, similare/identice cu enzimele descrise în FIG. 3.
HAP-urile cu greutate moleculară mică (HAP-LMW) sunt reductibile, hidrofobe și slab solubile și, prin urmare, nu sunt susceptibile la descompunere/degradare naturală. Cu toate acestea, microorganismele aerobe sunt capabile să le oxideze prin absorbția oxigenului molecular (O2). Aceste enzime aparțin în principal clasei oxidoreductazelor și pot efectua diverse reacții, cum ar fi hidroxilarea ciclului aromatic (mono- sau dihidroxilarea), dehidrogenarea și scindarea ciclului aromatic. Produșii obținuți din aceste reacții se află într-o stare de oxidare superioară și sunt metabolizați mai ușor prin calea centrală a carbonului (Phale et al., 2020). Enzimele din calea de degradare au fost raportate ca fiind inductibile. Activitatea acestor enzime este foarte scăzută sau neglijabilă atunci când celulele sunt cultivate pe surse simple de carbon, cum ar fi glucoza sau acizii organici. Tabelul 3 prezintă un rezumat al diferitelor enzime (oxigenaze, hidrolaze, dehidrogenaze, oxidaze etc.) implicate în metabolismul naftalinei și al derivaților acesteia.
Tabelul 3. Caracteristicile biochimice ale enzimelor responsabile de degradarea naftalinei și a derivaților acesteia.
Studiile radioizotopice (18O2) au arătat că încorporarea O2 molecular în inele aromatice de către oxigenaze este cea mai importantă etapă în activarea biodegradării ulterioare a unui compus (Hayaishi și colab., 1955; Mason și colab., 1955). Încorporarea unui atom de oxigen (O) din oxigenul molecular (O2) în substrat este inițiată fie de monooxigenaze endogene, fie de monooxigenaze exogene (numite și hidroxilaze). Un alt atom de oxigen este redus la apă. Monooxigenazele exogene reduc flavina cu NADH sau NADPH, în timp ce în endomonooxigenaze flavina este redusă de substrat. Poziția hidroxilării are ca rezultat o diversitate în formarea produsului. De exemplu, salicilat 1-hidroxilaza hidroxilează acidul salicilic în poziția C1, formând catecol. Pe de altă parte, salicilat 5-hidroxilaza multicomponentă (care conține subunități de reductază, feredoxină și oxigenază) hidroxilează acidul salicilic în poziția C5, formând acid gentisic (Yamamoto și colab., 1965).
Dioxigenazele încorporează doi atomi de O2 în substrat. În funcție de produsele formate, acestea se împart în dioxigenaze hidroxilante de inel și dioxigenaze care scindează inelul. Dioxigenazele hidroxilante de inel transformă substraturile aromatice în cis-dihidrodioli (de exemplu, naftalină) și sunt răspândite printre bacterii. Până în prezent, s-a demonstrat că organismele care conțin dioxigenaze hidroxilante de inel sunt capabile să crească pe diverse surse aromatice de carbon, iar aceste enzime sunt clasificate ca NDO (naftalină), toluen dioxigenază (TDO, toluen) și bifenil dioxigenază (BPDO, bifenil). Atât NDO, cât și BPDO pot cataliza dubla oxidare și hidroxilarea lanțului lateral al diferitelor hidrocarburi aromatice policiclice (toluen, nitrotoluen, xilen, etilbenzen, naftalină, bifenil, fluoren, indol, metilnaftalină, naftalensulfonat, fenantren, antracen, acetofenonă etc.) (Boyd și Sheldrake, 1998; Phale și colab., 2020). NDO este un sistem multicomponent format dintr-o oxidoreductază, o feredoxină și o componentă oxigenază care conține situs activ (Gibson și Subramanian, 1984; Resnick și colab., 1996). Unitatea catalitică a NDO constă dintr-o subunitate α mare și o subunitate β mică, aranjate într-o configurație α3β3. NDO aparține unei familii numeroase de oxigenaze, iar subunitatea sa α conține un situs Rieske [2Fe-2S] și un fier mononuclear non-hemic, care determină specificitatea substratului NDO (Parales și colab., 1998). De obicei, într-un ciclu catalitic, doi electroni din reducerea nucleotidului piridinic sunt transferați la ionul Fe(II) din situsul activ prin intermediul unei reductază, a unei feredoxine și a unui situs Rieske. Echivalenții reducători activează oxigenul molecular, care este o condiție prealabilă pentru dihidroxilarea substratului (Ferraro și colab., 2005). Până în prezent, doar câteva NDO au fost purificate și caracterizate în detaliu din diferite tulpini, iar controlul genetic al căilor implicate în degradarea naftalinei a fost studiat în detaliu (Resnick și colab., 1996; Parales și colab., 1998; Karlsson și colab., 2003). Dioxigenazele care scindează inelul (enzimele care scindează inelul endo- sau orto- și enzimele care scindează inelul exodiol- sau meta-) acționează asupra compușilor aromatici hidroxilați. De exemplu, dioxigenaza care scindează inelul orto este catecol-1,2-dioxigenaza, în timp ce dioxigenaza care scindează inelul meta este catecol-2,3-dioxigenaza (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Pe lângă diverse oxigenaze, există și diverse dehidrogenaze responsabile de dehidrogenarea dihidrodiolilor aromatici, alcoolilor și aldehidelor și de utilizarea NAD+/NADP+ ca acceptori de electroni, acestea fiind unele dintre enzimele importante implicate în metabolism (Gibson și Subramanian, 1984; Shaw și Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzimele precum hidrolazele (esteraze, amidaze) reprezintă o a doua clasă importantă de enzime care utilizează apa pentru a scinda legăturile covalente și prezintă o specificitate largă de substrat. Carbaril hidrolaza și alte hidrolaze sunt considerate a fi componente ale periplasmei (transmembranare) la membrii bacteriilor Gram-negative (Kamini și colab., 2018). Carbarilul are atât o legătură amidă, cât și una esterică; prin urmare, poate fi hidrolizat fie de esterază, fie de amidază pentru a forma 1-naftol. S-a raportat că carbarilul din Rhizobium rhizobium tulpina AC10023 și Arthrobacter tulpina RC100 funcționează ca esterază, respectiv amidază. Carbarilul din Arthrobacter tulpina RC100 funcționează, de asemenea, ca amidază. S-a demonstrat că RC100 hidrolizează patru insecticide din clasa N-metilcarbamat, cum ar fi carbarilul, metomilul, acidul mefenamic și XMC (Hayaatsu și colab., 2001). S-a raportat că CH în Pseudomonas sp. C5pp poate acționa asupra carbarilului (activitate 100%) și acetatului de 1-naftil (activitate 36%), dar nu asupra 1-naftilacetamidei, indicând faptul că este o esterază (Trivedi et al., 2016).
Studiile biochimice, modelele de reglare enzimatică și analiza genetică au arătat că genele de degradare a naftalinei constau din două unități de reglare inductibile sau „operoni”: nah („calea în amonte”, care transformă naftalina în acid salicilic) și sal („calea în aval”, care transformă acidul salicilic în calea centrală a carbonului prin intermediul catecolului). Acidul salicilic și analogii săi pot acționa ca inductori (Shamsuzzaman și Barnsley, 1974). În prezența glucozei sau a acizilor organici, operonul este reprimat. Figura 5 prezintă organizarea genetică completă a degradării naftalinei (sub formă de operon). Au fost descrise mai multe variante/forme denumite ale genei nah (ndo/pah/dox) și s-a constatat că au o omologie de secvență ridicată (90%) între toate speciile de Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Genele căii în amonte a naftalinei au fost în general aranjate într-o ordine consensuală, așa cum se arată în Figura 5A. O altă genă, nahQ, a fost, de asemenea, raportată ca fiind implicată în metabolismul naftalinei și a fost de obicei localizată între nahC și nahE, dar funcția sa reală rămâne de elucidat. În mod similar, gena nahY, responsabilă de chemotaxia sensibilă la naftalină, a fost găsită la capătul distal al operonului nah la unii membri. La Ralstonia sp., gena U2 care codifică glutation S-transferaza (gsh) a fost localizată între nahAa și nahAb, dar nu a afectat caracteristicile de utilizare a naftalinei (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organizarea și diversitatea genetică observate în timpul degradării naftalinei la speciile bacteriene; (A) Calea superioară a naftalinei, metabolismul naftalinei în acid salicilic; (B) Calea inferioară a naftalinei, acidul salicilic prin catecol către calea centrală a carbonului; (C) acidul salicilic prin gentisat către calea centrală a carbonului.
„Calea inferioară” (operonul sal) constă de obicei din nahGTHINLMOKJ și transformă salicilatul în piruvat și acetaldehidă prin intermediul căii de clivaj prin metaringa catecolului. S-a constatat că gena nahG (care codifică salicilat hidroxilaza) este conservată la capătul proximal al operonului (Fig. 5B). Comparativ cu alte tulpini care degradează naftalina, la P. putida CSV86 operonii nah și sal sunt în tandem și foarte strâns înrudiți (aproximativ 7,5 kb). La unele bacterii Gram-negative, cum ar fi Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 și P. putida AK5, naftalina este metabolizată ca metabolit central de carbon prin intermediul căii gentisat (sub forma operonului sgp/nag). Caseta genetică este reprezentată de obicei sub forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, unde nagR (care codifică un regulator de tip LysR) este situat la capătul superior (Figura 5C).
Carbarilul intră în ciclul central al carbonului prin metabolismul 1-naftolului, 1,2-dihidroxinaftalinei, acidului salicilic și acidului gentisic (Figura 3). Pe baza studiilor genetice și metabolice, s-a propus împărțirea acestei căi în „în amonte” (conversia carbarilului în acid salicilic), „în mijloc” (conversia acidului salicilic în acid gentisic) și „în aval” (conversia acidului gentisic în intermediari ai căii centrale a carbonului) (Singh și colab., 2013). Analiza genomică a C5pp (supercontig A, 76,3 kb) a relevat că gena mcbACBDEF este implicată în conversia carbarilului în acid salicilic, urmată de mcbIJKL în conversia acidului salicilic în acid gentisic și mcbOQP în conversia acidului gentisic în intermediari centrali de carbon (fumarat și piruvat, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
S-a raportat că enzimele implicate în degradarea hidrocarburilor aromatice (inclusiv naftalina și acidul salicilic) pot fi induse de compușii corespunzători și inhibate de surse simple de carbon, cum ar fi glucoza sau acizii organici (Shingler, 2003; Phale și colab., 2019, 2020). Printre diversele căi metabolice ale naftalinei și derivaților săi, caracteristicile de reglare ale naftalinei și carbarilului au fost studiate într-o oarecare măsură. Pentru naftalină, genele atât din căile din amonte, cât și din aval sunt reglate de NahR, un regulator pozitiv trans-acționare de tip LysR. Acesta este necesar pentru inducerea genei nah de către acidul salicilic și expresia sa ulterioară la nivel înalt (Yen și Gunsalus, 1982). În plus, studiile au arătat că factorul gazdă integrativ (IHF) și XylR (regulator transcripțional dependent de sigma 54) sunt, de asemenea, critici pentru activarea transcripțională a genelor în metabolismul naftalinei (Ramos și colab., 1997). Studiile au arătat că enzimele căii de deschidere a inelului meta-catecol, și anume cateco 2,3-dioxigenaza, sunt induse în prezența naftalinei și/sau a acidului salicilic (Basu și colab., 2006). Studiile au arătat că enzimele căii de deschidere a inelului orto-catecol, și anume cateco 1,2-dioxigenaza, sunt induse în prezența acidului benzoic și a cis,cis-muconatului (Parsek și colab., 1994; Tover și colab., 2001).
În tulpina C5pp, cinci gene, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR și mcbS, codifică regulatori aparținând familiei LysR/TetR de regulatori transcripționali responsabili de controlul degradării carbarilului. S-a constatat că gena omoloagă mcbG este cea mai strâns legată de regulatorul de tip LysR PhnS (identitate de aminoacizi 58%) implicat în metabolismul fenantrenului la Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). S-a constatat că gena mcbH este implicată în calea intermediară (conversia acidului salicilic în acid gentisic) și aparține regulatorului transcripțional de tip LysR NagR/DntR/NahR la Pseudomonas și Burkholderia. S-a raportat că membrii acestei familii recunosc acidul salicilic ca o moleculă efectoare specifică pentru inducerea genelor de degradare. Pe de altă parte, trei gene, mcbN, mcbR și mcbS, aparținând regulatorilor transcripționali de tip LysR și TetR, au fost identificate în calea din aval (metaboliți ai căii centrale de carbon gentisat).
La procariote, procesele de transfer orizontal de gene (achiziție, schimb sau transfer) prin plasmide, transpozoni, profaje, insule genomice și elemente integrative conjugative (ICE) sunt cauze majore ale plasticității în genomurile bacteriene, ducând la câștigarea sau pierderea unor funcții/trăsături specifice. Acestea permit bacteriilor să se adapteze rapid la diferite condiții de mediu, oferind gazdei potențiale avantaje metabolice adaptive, cum ar fi degradarea compușilor aromatici. Modificările metabolice sunt adesea realizate prin reglarea fină a operonilor de degradare, a mecanismelor lor de reglare și a specificităților enzimatice, ceea ce facilitează degradarea unei game mai largi de compuși aromatici (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). S-a constatat că casetele genetice pentru degradarea naftalinei sunt localizate pe o varietate de elemente mobile, cum ar fi plasmidele (conjugative și neconjugative), transpozonii, genomurile, ICE-urile și combinațiile diferitelor specii bacteriene (Figura 5). La Pseudomonas G7, operonii nah și sal ai plasmidei NAH7 sunt transcriși în aceeași orientare și fac parte dintr-un transpozon defect care necesită transpozaza Tn4653 pentru mobilizare (Sota et al., 2006). La tulpina Pseudomonas NCIB9816-4, gena a fost găsită pe plasmida conjugativă pDTG1 sub forma a doi operoni (la aproximativ 15 kb distanță) care au fost transcriși în direcții opuse (Dennis și Zylstra, 2004). La tulpina Pseudomonas putida AK5, plasmida neconjugativă pAK5 codifică enzima responsabilă de degradarea naftalinei prin calea gentisatului (Izmalkova et al., 2013). La tulpina Pseudomonas PMD-1, operonul nah este localizat pe cromozom, în timp ce operonul sal este localizat pe plasmida conjugativă pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Cu toate acestea, în Pseudomonas stutzeri AN10, toate genele de degradare a naftalinei (operonii nah și sal) sunt localizate pe cromozom și sunt probabil recrutate prin evenimente de transpoziție, recombinare și rearanjare (Bosch et al., 2000). În Pseudomonas sp. CSV86, operonii nah și sal sunt localizați în genom sub forma ICE (ICECSV86). Structura este protejată de tRNAGly, urmată de repetiții directe care indică situsuri de recombinare/atașare (attR și attL) și o integrază de tip fag localizată la ambele capete ale tRNAGly, fiind astfel similară din punct de vedere structural cu elementul ICEclc (ICEclcB13 în Pseudomonas knackmusii pentru degradarea clorocatecolului). S-a raportat că genele de pe ICE pot fi transferate prin conjugare cu o frecvență de transfer extrem de scăzută (10-8), transferând astfel proprietăți de degradare către receptor (Basu și Phale, 2008; Phale și colab., 2019).
Majoritatea genelor responsabile de degradarea carbarilului sunt localizate pe plasmide. Arthrobacter sp. RC100 conține trei plasmide (pRC1, pRC2 și pRC300), dintre care două plasmide conjugative, pRC1 și pRC2, codifică enzimele care transformă carbarilul în gentisat. Pe de altă parte, enzimele implicate în conversia gentisatului în metaboliții centrali de carbon sunt localizate pe cromozom (Hayaatsu et al., 1999). Bacterii din genul Rhizobium. Tulpina AC100, utilizată pentru conversia carbarilului în 1-naftol, conține plasmida pAC200, care poartă gena cehA care codifică CH ca parte a transpozonului Tnceh, înconjurată de secvențe asemănătoare elementelor de inserție (istA și istB) (Hashimoto et al., 2002). În tulpina CF06 de Sphingomonas, se crede că gena de degradare a carbarilului este prezentă în cinci plasmide: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 și pCF05. Omologia ADN a acestor plasmide este ridicată, indicând existența unui eveniment de duplicare genică (Feng et al., 1997). Într-un simbiont care degradează carbarilul, compus din două specii de Pseudomonas, tulpina 50581 conține o plasmidă conjugativă pCD1 (50 kb) care codifică gena mcd a carbaril hidrolazei, în timp ce plasmida conjugativă din tulpina 50552 codifică o enzimă care degradează 1-naftolul (Chapalamadugu și Chaudhry, 1991). În tulpina WM111 de Achromobacter, gena mcd a furadan hidrolazei este localizată pe o plasmidă de 100 kb (pPDL11). S-a demonstrat că această genă este prezentă pe diferite plasmide (100, 105, 115 sau 124 kb) la diferite bacterii din diferite regiuni geografice (Parekh și colab., 1995). În Pseudomonas sp. C5pp, toate genele responsabile de degradarea carbarilului sunt localizate într-un genom cu o secvență de 76,3 kb (Trivedi și colab., 2016). Analiza genomului (6,15 Mb) a relevat prezența a 42 de MGE și 36 de GEI, dintre care 17 MGE au fost localizate în supercontig A (76,3 kb) cu un conținut mediu asimetric de G+C (54-60% mol), sugerând posibile evenimente de transfer orizontal de gene (Trivedi și colab., 2016). P. putida XWY-1 prezintă un aranjament similar al genelor care degradează carbarilul, dar aceste gene sunt localizate pe o plasmidă (Zhu și colab., 2019).
Pe lângă eficiența metabolică la nivel biochimic și genomic, microorganismele prezintă și alte proprietăți sau răspunsuri, cum ar fi chemotaxia, proprietățile de modificare a suprafeței celulare, compartimentarea, utilizarea preferențială, producția de biosurfactanți etc., care le ajută să metabolizeze mai eficient poluanții aromatici în mediile contaminate (Figura 7).
Figura 7. Diferite strategii de răspuns celular ale bacteriilor ideale care degradează hidrocarburile aromatice pentru biodegradarea eficientă a compușilor poluanți străini.
Răspunsurile chemotactice sunt considerate factori care amplifică degradarea poluanților organici în ecosistemele poluate eterogen. (2002) a demonstrat că chemotaxia Pseudomonas sp. G7 la naftalină a crescut rata de degradare a naftalinei în sistemele acvatice. Tulpina de tip sălbatic G7 a degradat naftalina mult mai rapid decât o tulpină mutantă cu deficit de chemotaxie. Proteina NahY (538 de aminoacizi cu topologie membranară) s-a dovedit a fi co-transcrisă cu genele căii metacleavage de pe plasmida NAH7 și, la fel ca traductorii de chemotaxie, această proteină pare să funcționeze ca un chemoreceptor pentru degradarea naftalinei (Grimm și Harwood 1997). Un alt studiu realizat de Hansel și colab. (2009) a arătat că proteina este chemotactică, dar rata sa de degradare este ridicată. (2011) a demonstrat un răspuns chemotactic al Pseudomonas (P. putida) la naftalina gazoasă, în care difuzia în fază gazoasă a dus la un flux constant de naftalină către celule, ceea ce a controlat răspunsul chemotactic al celulelor. Cercetătorii au exploatat acest comportament chemotactic pentru a crea microbi care ar crește rata de degradare. Studiile au arătat că, prin intermediul căilor chemosenzoriale, se reglează și alte funcții celulare, cum ar fi diviziunea celulară, reglarea ciclului celular și formarea biofilmului, contribuind astfel la controlul ratei de degradare. Cu toate acestea, valorificarea acestei proprietăți (chemotaxie) pentru o degradare eficientă este împiedicată de mai multe blocaje. Principalele obstacole sunt: ​​(a) diferiți receptori paralogi recunosc aceiași compuși/liganzi; (b) existența unor receptori alternativi, adică tropismul energetic; (c) diferențe semnificative de secvență în domeniile senzoriale ale aceleiași familii de receptori; și (d) lipsa informațiilor despre principalele proteine ​​senzoriale bacteriene (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Uneori, biodegradarea hidrocarburilor aromatice produce mai mulți metaboliți/intermediari, care pot fi chemotactici pentru un grup de bacterii, dar repulsivi pentru altele, complicând și mai mult procesul. Pentru a identifica interacțiunile liganzilor (hidrocarburi aromatice) cu receptorii chimici, am construit proteine ​​senzoriale hibride (PcaY, McfR și NahY) prin fuzionarea domeniilor senzoriale și de semnalizare ale Pseudomonas putida și Escherichia coli, care vizează receptorii pentru acizi aromatici, intermediari TCA și respectiv naftalină (Luu et al., 2019).
Sub influența naftalinei și a altor hidrocarburi aromatice policiclice (HAP), structura membranei bacteriene și integritatea microorganismelor suferă modificări semnificative. Studiile au arătat că naftalina interferează cu interacțiunea lanțului acil prin interacțiuni hidrofobe, crescând astfel umflarea și fluiditatea membranei (Sikkema et al., 1995). Pentru a contracara acest efect negativ, bacteriile reglează fluiditatea membranei prin modificarea raportului și a compoziției acizilor grași dintre acizii grași cu lanț ramificat izo/anteizo și izomerizarea acizilor grași cis-nesaturați în izomerii trans corespunzători (Heipieper și de Bont, 1994). La Pseudomonas stutzeri crescută prin tratament cu naftalină, raportul dintre acizi grași saturați și nesaturați a crescut de la 1,1 la 2,1, în timp ce la Pseudomonas JS150 acest raport a crescut de la 7,5 la 12,0 (Mrozik et al., 2004). Când au fost cultivate pe naftalină, celulele Achromobacter KAs 3-5 au prezentat agregare celulară în jurul cristalelor de naftalină și o scădere a sarcinii de suprafață celulară (de la -22,5 la -2,5 mV), însoțită de condensare citoplasmatică și vacuolizare, indicând modificări ale structurii celulare și ale proprietăților suprafeței celulare (Mohapatra et al., 2019). Deși modificările celulare/de suprafață sunt direct asociate cu o mai bună absorbție a poluanților aromatici, strategiile relevante de bioinginerie nu au fost optimizate complet. Manipularea formei celulelor a fost rareori utilizată pentru a optimiza procesele biologice (Volke și Nikel, 2018). Ștergerea genelor care afectează diviziunea celulară provoacă modificări ale morfologiei celulare. Ștergerea genelor care afectează diviziunea celulară provoacă modificări ale morfologiei celulare. La Bacillus subtilis, s-a demonstrat că proteina SepF din septul celular este implicată în formarea septului și este necesară pentru etapele ulterioare ale diviziunii celulare, dar nu este o genă esențială. Ștergerea genelor care codifică hidrolazele peptidice glican din Bacillus subtilis a dus la alungirea celulară, creșterea ratei specifice de creștere și îmbunătățirea capacității de producție a enzimelor (Cui și colab., 2018).
Compartimentarea căii de degradare a carbarilului a fost propusă pentru a realiza o degradare eficientă a tulpinilor de Pseudomonas C5pp și C7 (Kamini et al., 2018). Se propune ca carbarilul să fie transportat în spațiul periplasmic prin septul membranei externe și/sau prin porine difuzibile. CH este o enzimă periplasmică ce catalizează hidroliza carbarilului la 1-naftol, care este mai stabil, mai hidrofob și mai toxic. CH este localizat în periplasmă și are o afinitate scăzută pentru carbaril, controlând astfel formarea 1-naftolului, prevenind astfel acumularea acestuia în celule și reducând toxicitatea sa pentru celule (Kamini et al., 2018). 1-naftolul rezultat este transportat în citoplasmă prin membrana internă prin partiționare și/sau difuzie, și este apoi hidroxilat la 1,2-dihidroxinaftalină de către enzima cu afinitate mare 1NH pentru un metabolism ulterior pe calea centrală a carbonului.
Deși microorganismele au capacitățile genetice și metabolice de a degrada sursele de carbon xenobiotice, structura ierarhică a utilizării lor (adică utilizarea preferențială a surselor de carbon simple față de cele complexe) reprezintă un obstacol major în calea biodegradării. Prezența și utilizarea surselor simple de carbon reduce activitatea genelor care codifică enzimele care degradează sursele de carbon complexe/nepreferate, cum ar fi HAP-urile. Un exemplu bine studiat este acela că, atunci când glucoza și lactoza sunt administrate concomitent Escherichia coli, glucoza este utilizată mai eficient decât lactoza (Jacob și Monod, 1965). S-a raportat că Pseudomonas degradează o varietate de HAP-uri și compuși xenobiotici ca surse de carbon. Ierarhia utilizării surselor de carbon la Pseudomonas este acizi organici > glucoză > compuși aromatici (Hylemon și Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Cu toate acestea, există o excepție. Interesant este că Pseudomonas sp. CSV86 prezintă o structură ierarhică unică ce utilizează preferențial hidrocarburi aromatice (acid benzoic, naftalină etc.) mai degrabă decât glucoză și co-metabolizează hidrocarburile aromatice cu acizii organici (Basu et al., 2006). La această bacterie, genele pentru degradarea și transportul hidrocarburilor aromatice nu sunt reglate negativ nici măcar în prezența unei a doua surse de carbon, cum ar fi glucoza sau acizii organici. Când a fost cultivată în mediu cu glucoză și hidrocarburi aromatice, s-a observat că genele pentru transportul și metabolismul glucozei au fost reglate negativ, hidrocarburile aromatice au fost utilizate în prima fază logaritmică, iar glucoza a fost utilizată în a doua fază logaritmică (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Pe de altă parte, prezența acizilor organici nu a afectat expresia metabolismului hidrocarburilor aromatice, așa că se așteaptă ca această bacterie să fie o tulpină candidată pentru studii de biodegradare (Phale et al., 2020).
Este bine cunoscut faptul că biotransformarea hidrocarburilor poate provoca stres oxidativ și suprareglarea enzimelor antioxidante în microorganisme. Biodegradarea ineficientă a naftalinei, atât în ​​celulele în fază staționară, cât și în prezența compușilor toxici, duce la formarea de specii reactive de oxigen (ROS) (Kang et al. 2006). Deoarece enzimele care degradează naftalina conțin clustere fier-sulfur, sub stres oxidativ, fierul din hem și proteinele fier-sulfur va fi oxidat, ducând la inactivarea proteinelor. Feredoxin-NADP+ reductaza (Fpr), împreună cu superoxid dismutaza (SOD), mediază reacția redox reversibilă dintre NADP+/NADPH și două molecule de feredoxină sau flavodoxină, eliminând astfel ROS și restabilind centrul fier-sulfur sub stres oxidativ (Li et al. 2006). S-a raportat că atât Fpr, cât și SodA (SOD) la Pseudomonas pot fi induse de stresul oxidativ, iar activitățile crescute ale SOD și catalazei au fost observate la patru tulpini de Pseudomonas (O1, W1, As1 și G1) în timpul creșterii în condiții de adăugare de naftalină (Kang et al., 2006). Studiile au arătat că adăugarea de antioxidanți precum acidul ascorbic sau fierul feros (Fe2+) poate crește rata de creștere a naftalinei. Când Rhodococcus erythropolis a crescut în mediu naftalinic, transcripția genelor citocromului P450 legate de stresul oxidativ, inclusiv sodA (Fe/Mn superoxid dismutaza), sodC (Cu/Zn superoxid dismutaza) și recA, a fost crescută (Sazykin et al., 2019). Analiza proteomică cantitativă comparativă a celulelor Pseudomonas cultivate în naftalină a arătat că reglarea în sus a diferitelor proteine ​​asociate cu răspunsul la stresul oxidativ este o strategie de gestionare a stresului (Herbst et al., 2013).
S-a raportat că microorganismele produc biosurfactanți sub acțiunea surselor de carbon hidrofobe. Acești surfactanți sunt compuși tensioactivi amfifilici care pot forma agregate la interfețele ulei-apă sau aer-apă. Acest lucru promovează pseudo-solubilizarea și facilitează adsorbția hidrocarburilor aromatice, rezultând o biodegradare eficientă (Rahman et al., 2002). Datorită acestor proprietăți, biosurfactanții sunt utilizați pe scară largă în diverse industrii. Adăugarea de surfactanți chimici sau biosurfactanți la culturile bacteriene poate spori eficiența și rata de degradare a hidrocarburilor. Printre biosurfactanți, ramnolipidele produse de Pseudomonas aeruginosa au fost studiate și caracterizate pe larg (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). În plus, alte tipuri de biosurfactanți includ lipopeptide (mucine de la Pseudomonas fluorescens), emulgatorul 378 (de la Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg și Ron, 1999), lipide dizaharidice de trehaloză de la Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenină de la Bacillus (Saraswathy și Hallberg, 2002) și surfactant de la Bacillus subtilis (Siegmund și Wagner, 1991) și Bacillus amyloliquefaciens (Zhi și colab., 2017). S-a demonstrat că acești surfactanți puternici reduc tensiunea superficială de la 72 dine/cm la mai puțin de 30 dine/cm, permițând o mai bună absorbție a hidrocarburilor. S-a raportat că Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia și alte specii bacteriene pot produce diverși biosurfactanți pe bază de ramnolipide și glicolipide atunci când sunt cultivate în medii cu naftalină și metilnaftalină (Kanga și colab., 1997; Puntus și colab., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 poate produce biosurfactantul extracelular Biosur-Pm atunci când este cultivat pe compuși aromatici precum acidul naftoic (Phale și colab., 1995). Cinetica formării Biosur-Pm a arătat că sinteza sa este un proces dependent de creștere și pH. S-a constatat că cantitatea de Biosur-Pm produsă de celule la pH neutru a fost mai mare decât cea la pH 8,5. Celulele cultivate la pH 8,5 au fost mai hidrofobe și au avut o afinitate mai mare pentru compușii aromatici și alifatici decât celulele cultivate la pH 7,0. La Rhodococcus spp. N6, un raport carbon-azot (C:N) mai mare și limitarea fierului sunt condiții optime pentru producerea de biosurfactanți extracelulari (Mutalik et al., 2008). S-au făcut încercări de a îmbunătăți biosinteza biosurfactanților (surfactinelor) prin optimizarea tulpinilor și a fermentației. Cu toate acestea, titrul de surfactant din mediul de cultură este scăzut (1,0 g/L), ceea ce reprezintă o provocare pentru producția la scară largă (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Prin urmare, s-au utilizat metode de inginerie genetică pentru a îmbunătăți biosinteza sa. Cu toate acestea, modificarea sa inginerească este dificilă din cauza dimensiunii mari a operonului (∼25 kb) și a reglării biosintetice complexe a sistemului de detectare a cvorumului (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). O serie de modificări prin inginerie genetică au fost efectuate la bacteriile Bacillus, având ca scop principal creșterea producției de surfactină prin înlocuirea promotorului (operonul srfA), supraexprimarea proteinei de export a surfactinei YerP și a factorilor de reglare ComX și PhrC (Jiao et al., 2017). Cu toate acestea, aceste metode de inginerie genetică au realizat doar una sau câteva modificări genetice și nu au ajuns încă în producția comercială. Prin urmare, sunt necesare studii suplimentare ale metodelor de optimizare bazate pe cunoștințe.
Studiile de biodegradare a HAP-urilor sunt efectuate în principal în condiții standard de laborator. Cu toate acestea, în locurile contaminate sau în mediile contaminate, s-a demonstrat că mulți factori abiotici și biotici (temperatura, pH-ul, oxigenul, disponibilitatea nutrienților, biodisponibilitatea substratului, alte xenobiotice, inhibarea produsului finit etc.) modifică și influențează capacitatea de degradare a microorganismelor.
Temperatura are un efect semnificativ asupra biodegradării HAP-urilor. Pe măsură ce temperatura crește, concentrația de oxigen dizolvat scade, ceea ce afectează metabolismul microorganismelor aerobe, deoarece acestea necesită oxigen molecular ca unul dintre substraturile pentru oxigenazele care efectuează reacții de hidroxilare sau de scindare a ciclului. Se observă adesea că temperatura ridicată transformă HAP-urile inițiale în compuși mai toxici, inhibând astfel biodegradarea (Muller et al., 1998).
S-a observat că multe situri contaminate cu HAP au valori extreme ale pH-ului, cum ar fi siturile contaminate cu drenaj minier acid (pH 1-4) și siturile de gazificare a gazelor naturale/cărbunelui contaminate cu levigat alcalin (pH 8-12). Aceste condiții pot afecta serios procesul de biodegradare. Prin urmare, înainte de a utiliza microorganisme pentru bioremediere, se recomandă ajustarea pH-ului prin adăugarea de substanțe chimice adecvate (cu potențial de oxidare-reducere moderat până la foarte scăzut), cum ar fi sulfatul de amoniu sau nitratul de amoniu pentru solurile alcaline sau tratarea cu var cu carbonat de calciu sau carbonat de magneziu pentru siturile acide (Bowlen et al. 1995; Gupta și Sar 2020).
Alimentarea cu oxigen a zonei afectate este factorul limitator al biodegradării HAP. Datorită condițiilor redox ale mediului, procesele de bioremediere in situ necesită de obicei introducerea de oxigen din surse externe (arătură, barbotare cu aer și adăugare de substanțe chimice) (Pardieck și colab., 1992). Odenkranz și colab. (1996) au demonstrat că adăugarea de peroxid de magneziu (un compus eliberator de oxigen) la un acvifer contaminat ar putea bioremedia eficient compușii BTEX. Un alt studiu a investigat degradarea in situ a fenolului și BTEX într-un acvifer contaminat prin injectarea de nitrat de sodiu și construirea de puțuri de extracție pentru a obține o bioremediere eficientă (Bewley și Webb, 2001).