Prezent *Adresă curentă: Köln 50931, Germania, Köln Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-wild-wildness Diseases (CECAD).
Neurodegenerarea bolilor mitocondriale este considerată ireversibilă deoarece plasticitatea metabolică a neuronilor este limitată, dar efectul disfuncției mitocondriale asupra autonomiei celulare a metabolismului neuronal în organism este puțin înțeles. Aici, introducem proteomul specific celulei neuronilor Purkinje cu deficit progresiv de OXPHOS cauzat de dinamica perturbată a fuziunii mitocondriale. Am descoperit că disfuncția mitocondrială a declanșat o schimbare profundă în domeniul proteomicii, care a dus în cele din urmă la activarea secvențială a unor programe metabolice precise înainte de moartea celulară. În mod neașteptat, am determinat inducerea evidentă a piruvat carboxilazei (PCx) și a altor enzime anti-îmbătrânire care suplimentează intermediarii ciclului TCA. Inhibarea PCx a exacerbat stresul oxidativ și neurodegenerarea, indicând faptul că ateroscleroza are un efect protector la neuronii cărora le lipsește OXPHOS. Restaurarea fuziunii mitocondriale în neuronii degenerați terminal inversează complet aceste caracteristici metabolice, prevenind astfel moartea celulară. Constatările noastre identifică căi necunoscute anterior care conferă rezistență la disfuncția mitocondrială și arată că neurodegenerarea poate fi inversată chiar și în stadiile avansate ale bolii.
Rolul central al mitocondriilor în menținerea metabolismului energetic neuronal este subliniat de simptomele neurologice extinse asociate cu bolile mitocondriale umane. Majoritatea acestor boli sunt cauzate de mutații genetice care reglează expresia genelor mitocondriale (1, 2) sau de distrugerea genelor legate de dinamica mitocondrială, care afectează indirect stabilitatea ADN-ului mitocondrial (ADNmt) (3, 4). Studiile pe modele animale au arătat că, ca răspuns la disfuncția mitocondrială din țesuturile înconjurătoare, pot fi activate căi metabolice conservatoare (5-7), ceea ce oferă informații importante pentru înțelegerea aprofundată a patogenezei acestor boli complexe. În contrast puternic, înțelegerea noastră asupra modificărilor metabolice ale anumitor tipuri de celule cauzate de eșecul general al producției de adenozin trifosfat (ATP) mitocondrial din creier este fundamentală (8), subliniind necesitatea identificării țintelor terapeutice care pot fi utilizate pentru a preveni sau preveni bolile. Prevenirea neurodegenerării (9). Lipsa de informații se datorează faptului că celulele nervoase sunt considerate pe scară largă a avea o flexibilitate metabolică foarte limitată în comparație cu tipurile de celule ale țesuturilor înconjurătoare (10). Având în vedere că aceste celule joacă un rol central în coordonarea aportului de metaboliți către neuroni pentru a promova transmiterea sinaptică și a răspunde la leziuni și boli, capacitatea de a adapta metabolismul celular la condițiile dificile ale țesutului cerebral este aproape limitată la celulele gliale (11-14). În plus, eterogenitatea celulară inerentă a țesutului cerebral împiedică în mare măsură studiul modificărilor metabolice care apar în anumite subgrupuri neuronale. Prin urmare, se cunosc puține lucruri despre consecințele celulare și metabolice exacte ale disfuncției mitocondriale la nivelul neuronilor.
Pentru a înțelege consecințele metabolice ale disfuncției mitocondriale, am izolat neuronii Purkinje (PN) în diferite stadii de neurodegenerare cauzată de distrugerea membranei externe mitocondriale de fuziune (Mfn2). Deși mutațiile Mfn2 la om sunt asociate cu o formă de neuropatie senzorială motorie ereditară cunoscută sub numele de Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15), distrugerea condiționată a Mfn2 la șoareci este o metodă bine recunoscută de inducție a disfuncției de fosforilare oxidativă (OXPHOS). Diversele subtipuri neuronale (16-19) și fenotipul neurodegenerativ rezultat sunt însoțite de simptome neurologice progresive, cum ar fi tulburări de mișcare (18, 19) sau ataxie cerebeloasă (16). Prin utilizarea unei combinații de proteomică cantitativă fără marcaj (LFQ), metabolomică, imagistică și metode virologice, demonstrăm că neurodegenerarea progresivă induce puternic piruvat carboxilaza (PCx) și alți factori implicați în arterioscleroza PN in vivo. Pentru a verifica relevanța acestei descoperiri, am redus în mod specific expresia PCx în PN cu deficit de Mfn2 și am constatat că această operație a agravat stresul oxidativ și a accelerat neurodegenerarea, dovedind astfel că azoospermia conferă moarte celulară, adaptabilitate metabolică. Expresia severă a MFN2 poate salva complet PN degenerativă terminală cu deficit sever de OXPHOS, consum masiv de ADN mitocondrial și rețea mitocondrială aparent ruptă, ceea ce subliniază în continuare că această formă de neurodegenerare se poate recupera chiar și în stadiul avansat al bolii, înainte de moartea celulară.
Pentru a vizualiza mitocondriile în PN cu Mfn2 knockout, am utilizat o tulpină de șoarece care permite mitocondriilor dependente de Cre să vizeze proteina fluorescentă galbenă (YFP) (mtYFP) (20). Expresia Cre și am verificat morfologia mitocondrială in vivo. Am constatat că distrugerea genei Mfn2 în PN ar duce la divizarea treptată a rețelei mitocondriale (Figura S1A), iar cea mai timpurie modificare a fost observată la vârsta de 3 săptămâni. În schimb, degenerarea substanțială a stratului celular PN, evidențiată de pierderea imunomarcajului cu Calbindin, nu a început decât la vârsta de 12 săptămâni (Figura 1, A și B). Neconcordanța de timp dintre cele mai timpurii modificări ale morfologiei mitocondriale și debutul vizibil al morții neuronale ne-a determinat să investigăm modificările metabolice declanșate de disfuncția mitocondrială înainte de moartea celulară. Am dezvoltat o strategie bazată pe sortarea celulelor activate prin fluorescență (FACS) pentru a izola PN care exprimă YFP (YFP+) (Figura 1C) și la șoareci de control (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), denumite în continuare CTRL (Figura S1B). Optimizarea strategiei de activare bazată pe intensitatea relativă a semnalului YFP ne permite să purificăm corpul YFP+ (YFPhigh) al PN-urilor din non-PN (YFPneg) (Figura S1B) sau din presupuse fragmente fluorescente de axoni/dendritice (YFPlow; Figura S1D, stânga), confirmat prin microscop confocal (Figura S1D, dreapta). Pentru a verifica identitatea populației clasificate, am efectuat proteomică LFQ și apoi analiza componentelor principale și am constatat că există o separare clară între celulele YFPhigh și YFPneg (Figura S1C). Celulele YFPhigh au arătat o îmbogățire netă a markerilor PN cunoscuți (de exemplu, Calb1, Pcp2, Grid2 și Itpr3) (21, 22), dar nicio îmbogățire a proteinelor exprimate în mod obișnuit în neuroni sau alte tipuri de celule (Figura 1D). O comparație între probele din celulele YFPhigh clasificate colectate în experimente independente a arătat un coeficient de corelație > 0,9, demonstrând o bună reproductibilitate între replicatele biologice (Figura S1E). În concluzie, aceste date au validat planul nostru pentru izolarea acută și specifică a PN fezabile. Deoarece sistemul driver L7-cre utilizat induce recombinarea mozaică în prima săptămână după naștere (23), am început să sacrificăm șoarecii din stratul CTRL și din modul condiționat (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) de colectare a neuronilor. După finalizarea recombinării, aceasta se numește Mfn2cKO la vârsta de 4 săptămâni. Ca punct final, am ales vârsta de 8 săptămâni, când stratul PN era intact, în ciuda fragmentării mitocondriale evidente (Figura 1B și Figura S1A). În total, am cuantificat un număr total de 3013 proteine, dintre care aproximativ 22% s-au bazat pe adnotările MitoCarta 2.0 bazate pe proteomul mitocondrial ca mitocondrii (Figura 1E) (Figura 1E) (24). Analiza expresiei genice diferențiale efectuată în săptămâna 8 a arătat că doar 10,5% din toate proteinele au prezentat modificări semnificative (Figura 1F și Figura S1F), dintre care 195 de proteine ​​au fost reglate negativ și 120 de proteine ​​au fost reglate pozitiv (Figura 1F). Este demn de remarcat faptul că „analiza căilor inovatoare” a acestui set de date arată că genele exprimate diferențial aparțin în principal unui set restrâns de căi metabolice specifice (Figura 1G). Interesant este că, deși reglarea negativă a căilor legate de OXPHOS și semnalizarea calciului confirmă inducerea disfuncției mitocondriale în PN cu deficit de fuziune, alte categorii care implică în principal metabolismul aminoacizilor sunt reglate semnificativ pozitiv, ceea ce este în concordanță cu metabolismul care are loc în PN mitocondriale. Recablarea este consistentă.
(A) Fotografii confocale reprezentative ale secțiunilor cerebeloase ale șoarecilor CTRL și Mfn2cKO care prezintă pierderea progresivă a PN-urilor (calbindină, gri); nucleii au fost contracolorați cu DAPI. (B) Cuantificarea (A) (analiză unidirecțională a varianței, ***P<0,001; n = 4 până la 6 cercuri de la trei șoareci). (C) Flux de lucru experimental. (D) Distribuția hărții termice a markerilor specifici Purkinje (sus) și altor tipuri de celule (mijloc). (E) Diagramă Venn care arată numărul de proteine ​​mitocondriale identificate în PN clasificată. (F) Diagrama vulcanică a proteinelor exprimate diferențial în neuronii Mfn2cKO la 8 săptămâni (valoare limită de semnificație de 1,3). (G) Analiza căii creativității arată cele mai importante cinci căi de suprareglare (roșu) și de subreglare (albastru) în PN Mfn2cKO clasificată ca fiind la 8 săptămâni. Este prezentat nivelul mediu de expresie al fiecărei proteine ​​detectate. Hartă termică în tonuri de gri: valoare P ajustată. ns, neimportant.
Datele proteomice au arătat că expresia proteinelor complexelor I, III și IV a scăzut treptat. Complexele I, III și IV conțineau toate subunități esențiale codificate de ADNmt, în timp ce complexul II, care era codificat doar nuclear, a fost practic neafectat (Figura 2A și Figura S2A). În concordanță cu rezultatele proteomice, imunohistochimia secțiunilor de țesut cerebelos a arătat că nivelul subunității MTCO1 (subunitatea 1 a citocromului C oxidazei mitocondriale) a complexului IV în PN a scăzut treptat (Figura 2B). Subunitatea Mtatp8 codificată de ADNmt a fost semnificativ redusă (Figura S2A), în timp ce nivelul în stare stabilă al subunității ATP sintazei codificate nuclear a rămas neschimbat, ceea ce este în concordanță cu complexul F1 al subansamblului ATP sintazei stabil cunoscut atunci când expresia ADNmt este stabilă. Formarea este consistentă. Întrerupere (7). Evaluarea nivelului de ADNmt în celulele nucleare mitocondriale (PN) Mfn2cKO sortate prin reacție în lanț a polimerazei în timp real (qPCR) a confirmat scăderea treptată a numărului de copii de ADNmt. Comparativ cu grupul de control, la vârsta de 8 săptămâni, doar aproximativ 20% din nivelul de ADNmt a fost reținut (Figura 2C). În concordanță cu aceste rezultate, colorarea prin microscopie confocală a PN Mfn2cKO a fost utilizată pentru a detecta ADN-ul, arătând consumul dependent de timp al nucleotidelor mitocondriale (Figura 2D). Am constatat că doar unii candidați implicați în degradarea proteinelor mitocondriale și răspunsul la stres au fost suprareglați, inclusiv Lonp1, Afg3l2 și Clpx, precum și factorii de asamblare ai complexului OXPHOS. Nu au fost detectate modificări semnificative ale nivelurilor de proteine ​​implicate în apoptoză (Figura S2B). În mod similar, am constatat că canalele mitocondriale și reticulului endoplasmatic implicate în transportul calciului prezintă doar modificări minore (Figura S2C). În plus, evaluarea proteinelor legate de autofagie nu a constatat modificări semnificative, ceea ce este în concordanță cu inducerea vizibilă a autofagozomilor observată in vivo prin imunohistochimie și microscopie electronică (Figura S3). Cu toate acestea, disfuncția OXPHOS progresivă în PN este însoțită de modificări mitocondriale ultrastructurale evidente. Grupuri mitocondriale pot fi observate în corpurile celulare și arborii dendritici ai PN Mfn2cKO cu vârsta de 5 și 8 săptămâni, iar structura membranei interne a suferit modificări profunde (Figura S4, A și B). În concordanță cu aceste modificări ultrastructurale și o scădere semnificativă a ADNmt, analiza feliilor cerebrale cerebeloase acute cu ester metilic de tetrametilrodamină (TMRM) a arătat că potențialul membranei mitocondriale în PN Mfn2cKO a fost semnificativ scăzut (Figura S4C).
(A) Analiza în timp a nivelului de expresie a complexului OXPHOS. Se iau în considerare doar proteinele cu P<0,05 la 8 săptămâni (ANOVA bidirecțională). Linie punctată: Fără ajustare în comparație cu CTRL. (B) Stânga: Un exemplu de secțiune cerebeloasă marcată cu anticorp anti-MTCO1 (bare de scală, 20 μm). Zona ocupată de corpurile celulare Purkinje este acoperită cu galben. Dreapta: Cuantificarea nivelurilor de MTCO1 (analiză unidirecțională a varianței; n = 7 până la 20 de celule analizate de la trei șoareci). (C) Analiza qPCR a numărului de copii mtADN în PN sortată (analiză unidirecțională a varianței; n = 3 până la 7 șoareci). (D) Stânga: Un exemplu de felie cerebeloasă marcată cu un anticorp anti-ADN (bare de scală, 20 μm). Zona ocupată de corpurile celulare Purkinje este acoperită cu galben. Dreapta: Cuantificarea leziunilor mtADN (analiză unidirecțională a varianței; n = 5 până la 9 celule de la trei șoareci). (E) Un exemplu de secțiune cerebeloasă acută care prezintă celule mitoYFP + Purkinje (săgeată) într-o înregistrare patch clamp cu celule întregi. (F) Cuantificarea curbei IV. (G) Înregistrări reprezentative ale injectării de curent depolarizant în celulele Purkinje CTRL și Mfn2cKO. Urma superioară: Primul impuls care a declanșat PA. Urma inferioară: Frecvența maximă PA. (H) Cuantificarea intrărilor spontane postsinaptice (sPSP). Urma reprezentativă de înregistrare și raportul său de zoom sunt prezentate în (I). Analiza varianței într-o singură direcție a analizat n = 5 până la 20 de celule de la trei șoareci. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Urme reprezentative de PA spontane înregistrate folosind modul perforat patch clamp. Urma superioară: Frecvența maximă PA. Urma inferioară: zoomul unui singur PA. (K) Cuantificarea frecvenței medii și maxime PA conform (J). Testul Mann-Whitney; n = 5 celule au fost analizate de la patru șoareci. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM; nu sunt importante.
O deteriorare evidentă a OXPHOS a fost detectată la neuronii neuronali cu deficit de OXPHOS, cu vârsta de 8 săptămâni, indicând faptul că funcția fiziologică a neuronilor este sever anormală. Prin urmare, am analizat caracteristicile electrice pasive ale neuronilor cu deficit de OXPHOS la 4 până la 5 săptămâni și la 7 până la 8 săptămâni, efectuând înregistrări cu patch clamp pe celule întregi în secțiuni cerebeloase acute (Figura 2E). În mod neașteptat, potențialul mediu al membranei de repaus și rezistența de intrare a neuronilor Mfn2cKO au fost similare cu cele din grupul de control, deși au existat diferențe subtile între celule (Tabelul 1). În mod similar, la vârsta de 4 până la 5 săptămâni, nu s-au constatat modificări semnificative ale relației curent-tensiune (curba IV) (Figura 2F). Cu toate acestea, niciun neuron Mfn2cKO cu vârsta de 7 până la 8 săptămâni nu a supraviețuit regimului IV (etapa de hiperpolarizare), indicând faptul că există o sensibilitate clară la potențialul de hiperpolarizare în această etapă târzie. În schimb, în ​​neuronii Mfn2cKO, curenții depolarizanți care provoacă descărcări ale potențialului de acțiune repetitiv (PA) sunt bine tolerați, indicând faptul că modelele lor generale de descărcare nu sunt semnificativ diferite de cele ale neuronilor de control în vârstă de 8 săptămâni (Tabelul 1 și Figura 2G). În mod similar, frecvența și amplitudinea curenților postsinaptici spontani (sPSC) au fost comparabile cu cele ale grupului de control, iar frecvența evenimentelor a crescut de la 4 săptămâni la 5 săptămâni la 7 săptămâni la 8 săptămâni cu o creștere similară (Figura 2, H și I). Perioada de maturare sinaptică în PN (25). Rezultate similare au fost obținute după patch-uri perforate de PN. Această configurație previne posibila compensare a defectelor celulare de ATP, așa cum s-ar putea întâmpla în înregistrarea cu patch clamp la nivel celular. În special, potențialul membranei de repaus și frecvența de declanșare spontană a neuronilor Mfn2cKO nu au fost afectate (Figura 2, J și K). În concluzie, aceste rezultate indică faptul că neuronele percutanate cu disfuncție OXPHOS evidentă pot face față bine modelelor de descărcare de înaltă frecvență, ceea ce indică faptul că există un mecanism de compensare care le permite să mențină răspunsuri electrofiziologice aproape normale.
Datele sunt exprimate ca medie ± SEM (analiză a varianței într-o singură direcție, testul Holm-Sidak pentru comparații multiple; *P<0,05). Numărul unității este indicat prin paranteze.
Ne-am propus să investigăm dacă vreo categorie din setul de date proteomice (Figura 1G) include căi care pot contracara deficitul sever de OXPHOS, explicând astfel de ce NP afectată poate menține o electrofiziologie aproape normală (Figura 2, E până la K). Analiza proteomică a arătat că enzimele implicate în catabolismul aminoacizilor cu lanț ramificat (BCAA) au fost semnificativ suprareglate (Figura 3A și Figura S5A), iar produsul final acetil-CoA (CoA) sau succinil CoA poate suplimenta tricarboxilații în ciclul acidului arteriosclerotic (TCA). Am constatat că amândouă au crescut conținutul de transaminază BCAA 1 (BCAT1) și BCAT2. Acestea catalizează prima etapă a catabolismului BCAA prin generarea de glutamat din α-cetoglutarat (26). Toate subunitățile care alcătuiesc complexul cetoacid dehidrogenază cu lanț ramificat (BCKD) sunt suprareglate (complexul catalizează decarboxilarea ulterioară și ireversibilă a scheletului de carbon BCAA rezultat) (Figura 3A și Figura S5A). Cu toate acestea, nu s-au constatat modificări evidente ale BCAA în sine în PN sortate, ceea ce se poate datora absorbției celulare crescute a acestor aminoacizi esențiali sau utilizării altor surse (glucoză sau acid lactic) pentru a suplimenta ciclul TCA (Figura S5B). PN cărora le lipsește OXPHOS au prezentat, de asemenea, o creștere a activităților de descompunere și transaminare a glutaminei la vârsta de 8 săptămâni, ceea ce poate fi reflectat prin suprareglarea enzimelor mitocondriale glutaminază (GLS) și glutamină piruvat transaminază 2 (GPT2) (Figura 3, A și C). Este demn de remarcat faptul că suprareglarea GLS este limitată la izoforma glutaminazei C îmbinate (GLS-GAC) (modificarea Mfn2cKO/CTRL este de aproximativ 4,5 ori, P = 0,05), iar suprareglarea sa specifică în țesuturile canceroase poate susține bioenergia mitocondrială. (27).
(A) Harta termică arată modificarea nivelului de proteine ​​pentru calea specificată la 8 săptămâni. (B) Exemplu de felie cerebeloasă marcată cu anticorp anti-PCx (bare de scală, 20 μm). Săgeata galbenă indică corpul celular Purkinje. (C) Analiza expresiei proteinelor în timp, identificată ca un candidat important pentru ateroscleroză (test t multiplu, *FDR <5%; n = 3-5 șoareci). (D) Sus: O diagramă schematică care prezintă diferitele modalități de intrare a carbonului marcat conținut în trasorul [1-13C]piruvat (adică, prin PDH sau cale trans-arterială). Jos: Graficul vioară arată procentul de carbon marcat unic (M1) convertit în acid aspartic, acid citric și acid malic după marcarea feliilor cerebeloase acute cu [1-13C]piruvat (test t pereche; ** P <0,01). (E) Analiză cuprinzătoare a istoricului temporal al căii indicate. Se iau în considerare doar proteinele cu P<0,05 la 8 săptămâni. Linie punctată: fără valoare de ajustare (analiză bidirecțională a varianței; * P <0,05; *** P <0,001). Datele sunt exprimate ca medie ± SEM.
În analiza noastră, catabolismul BCAA a devenit una dintre căile cheie de suprareglare. Acest fapt sugerează cu tărie că volumul de ventilație care intră în ciclul TCA poate fi modificat în PN cu deficit de OXPHOS. Aceasta poate reprezenta o formă majoră de reconectare metabolică neuronală, care poate avea un impact direct asupra fiziologiei neuronale și a supraviețuirii în timpul menținerii disfuncției OXPHOS severe. În concordanță cu această ipoteză, am constatat că principala enzimă anti-aterosclerotică PCx este suprareglată (Mfn2cKO/CTRL se modifică de aproximativ 1,5 ori; Figura 3A), ceea ce catalizează conversia piruvatului în oxaloacetat (28), despre care se crede că se află în țesutul cerebral. Expresia în este limitată la astrocite (29, 30). În concordanță cu rezultatele proteomice, microscopia confocală a arătat că expresia PCx a fost crescută în mod specific și semnificativ în PN cu deficit de OXPHOS, în timp ce reactivitatea PCx a fost limitată în principal la celulele gliale Bergmann adiacente ale controlului (Figura 3B). Pentru a testa funcțional suprareglarea observată a PCx, am tratat secțiuni cerebeloase acute cu trasorul [1-13C]piruvat. Când piruvatul a fost oxidat de piruvat dehidrogenază (PDH), marcajul său izotopic a dispărut, dar este încorporat în intermediarii ciclului TCA atunci când piruvatul este metabolizat prin reacții vasculare (Figura 3D). În sprijinul datelor noastre proteomice, am observat un număr mare de markeri de la acest trasor în acidul aspartic al secțiunilor Mfn2cKO, în timp ce acidul citric și acidul malic au avut, de asemenea, o tendință moderată, deși nu semnificativă (Figura 3D).
În neuronii dopaminergici ai șoarecilor MitoPark cu disfuncție mitocondrială cauzată de neuronii dopaminergici care distrug în mod specific gena factorului de transcripție mitocondrial A (Tfam) (Figura S6B), expresia PCx a fost, de asemenea, semnificativ suprareglată (31), indicând faptul că apariția bolii este reglată în timpul disfuncției OXPHOS neuronale din organism. Este demn de remarcat faptul că s-a constatat că enzimele unice (32-34) care pot fi exprimate în neuronii care pot fi asociați cu arterioscleroza sunt semnificativ suprareglate în neuronii percutanați cărora le lipsește OXPHOS, cum ar fi propionil-CoA carboxilaza (PCC-A), malonil-CoA care transformă propionil-CoA în succinil-CoA și enzima malică mitocondrială 3 (ME3), al cărei rol principal este de a recupera piruvatul din malat (Figura 3, A și C) (33, 35). În plus, am observat o creștere semnificativă a enzimei Pdk3, care fosforilează și astfel inactivează PDH (36), în timp ce nu s-au detectat modificări la nivelul enzimei Pdp1 care activează PDH sau al complexului enzimatic PDH în sine (Figura 3A). În mod constant, în celulele parietale Mern2cKO, fosforilarea subunității α1 α (PDHE1α) a componentei E1 a piruvat dehidrogenazei din complexul PDH din Ser293 (cunoscută pentru inhibarea activității enzimatice a PDH) a fost amplificată (Figura S6C) (Figura S6C). Piruvatul nu are acces vascular.
În cele din urmă, am descoperit că super-calea biosintezei serinei și glicinei, ciclul aferent al folatului mitocondrial (1C) și biosinteza prolinei (Figura 1G și Figura S5C) sunt toate semnificativ suprareglate, conform rapoartelor, în timpul procesului de activare. Țesuturile înconjurătoare sunt activate cu disfuncție mitocondrială (5-7). Analiza confocală care susține aceste date proteomice a arătat că, în NP cu OXPHOS absent, feliile cerebeloase de șoareci în vârstă de 8 săptămâni au fost supuse serin hidroximetiltransferază 2 (SHMT2), o enzimă cheie a ciclului folatului mitocondrial. Răspuns imun semnificativ (Figura S5D). În 13 felii cerebeloase acute incubate cu CU-glucoză, experimentele de trasare metabolică au confirmat în continuare suprareglarea biosintezei serinei și prolinei, indicând faptul că fluxul de izoforme de carbon în serină și prolină a crescut (Figura S5E). Întrucât reacțiile promovate de GLS și GPT2 sunt responsabile pentru sinteza glutamatului din glutamină și transaminarea dintre glutamat și α-ketoglutarat, suprareglarea lor indică faptul că neuronii cu deficit de OXPHOS au o cerere crescută de glutamat. Acest lucru poate avea ca scop menținerea biosintezei crescute a prolinei (Figura S5C). Spre deosebire de aceste modificări, o analiză proteomică a astrocitelor cerebeloase de la șoareci Mfn2cKO specifici PN a arătat că aceste căi (inclusiv toate antiperoxidazele) nu s-au modificat semnificativ în expresie, demonstrând astfel că această redirecționare metabolică este selectivă față de PN degradată (Fig. S6, D până la G).
În concluzie, aceste analize au relevat modele semnificativ diferite de activare temporală a unor căi metabolice specifice în neuropatiile paracetamile (PN). Deși funcția mitocondrială neuronală anormală poate duce la ateroscleroză precoce și remodelare 1C (Figura 3E și Figura S5C) și chiar la modificări previzibile ale expresiei complexelor I și IV, modificările sintezei de novo a serinei sunt evidente doar în stadiile avansate. Disfuncția OXPHOS (Figura 3E și Figura S5C) este evidentă doar în stadiile avansate. Aceste descoperiri definesc un proces secvențial în care factorii mitocondriali (ciclul 1C) și citoplasmatici (biosinteza serinei) induși de stres răspund sinergic cu creșterea aterosclerozei în ciclul TCA pentru a remodela metabolismul neuronal.
PN cu deficit de OXPHOS, în vârstă de 8 săptămâni, pot menține o activitate de excitație de înaltă frecvență și pot suferi o reconectare metabolică semnificativă pentru a compensa disfuncția mitocondrială. Această descoperire ridică o posibilitate interesantă, și anume că, chiar și în acest moment, aceste celule ar putea primi intervenție terapeutică pentru a întârzia sau preveni neurodegenerarea tardiv. Am rezolvat această posibilitate prin două intervenții independente. În prima metodă, am conceput un vector de virus adeno-asociat (AAV) dependent de Cre, astfel încât MFN2 să poată fi exprimat selectiv în PN cu deficit de OXPHOS in vivo (Figura S7A). AAV care codifică MFN2 și gena reporter fluorescentă mCherry (Mfn2-AAV) au fost verificate în culturi neuronale primare in vitro, ceea ce a determinat exprimarea MFN2 într-o manieră dependentă de Cre și a salvat morfologia mitocondrială, prevenind astfel neuromutația în neuronii Mfn2cKO (Figura S7, B, D și E). În continuare, am efectuat experimente in vivo pentru a administra stereotactic Mfn2-AAV în vârstă de 8 săptămâni în cortexul cerebelos al șoarecilor Mfn2cKO și de control și am analizat șoareci în vârstă de 12 săptămâni (Figura 4A). Șoarecii Mfn2cKO tratați au murit (Figura 1, A și B) (16). Transducția virală in vivo a dus la exprimarea selectivă a PN în unele cercuri cerebeloase (Figura S7, G și H). Injectarea AAV de control care exprimă doar mCherry (Ctrl-AAV) nu a avut un efect semnificativ asupra gradului de neurodegenerare la animalele Mfn2cKO. În schimb, analiza Mfn2cKO transduși cu Mfn2-AAV a arătat un efect protector semnificativ al stratului de celule PN (Figura 4, B și C). În special, densitatea neuronilor pare a fi aproape imposibil de distins de cea a animalelor de control (Figura 4, B și C și Figura S7, H și I). Expresia MFN1, dar nu și a MFN2, este la fel de eficientă în salvarea morții neuronale (Figura 4C și Figura S7, C și F), ceea ce indică faptul că exprimarea MFN1 ectopic poate suplimenta eficient lipsa MFN2. Analize ulterioare la nivelul unei singure neuropatii (NP) au arătat că Mfn2-AAV a salvat în mare măsură ultrastructura mitocondriilor, a normalizat nivelurile de ADNmt și a inversat expresia ridicată a markerului anti-angiogeneză PCx (Figura 4, C până la E). Inspecția vizuală a șoarecilor Mfn2cKO salvați în stare de repaus a arătat că postura și simptomele lor motorii (mișcarea S1 până la S3) s-au îmbunătățit. În concluzie, aceste experimente arată că reintroducerea întârziată a MFN2 în NP cu deficit sever de OXPHOS este suficientă pentru a inversa consumul de ADNmt și a induce ateroscleroza, prevenind astfel degenerarea axonilor și moartea neuronală in vivo.
(A) O schemă care prezintă programul experimental pentru injectarea AAV care codifică MFN2 atunci când este activată calea metabolică indicată. (B) Imagini confocale reprezentative ale unor secțiuni cerebeloase de 12 săptămâni, transduse la 8 săptămâni la șoareci Mfn2cKO și marcate cu anticorp anti-Calbindin. Dreapta: Scalarea fibrelor axonale. Scara zoom-ului axonal este de 450 și 75 μm. (C) Stânga: Cuantificarea densității celulelor Purkinje în bucla de transducție AAV (AAV+) (analiză unidirecțională a varianței; n = 3 șoareci). Dreapta: analiza focalizării mtADN în PN transdusă la săptămâna 12 (test t nepereche; n = 6 celule de la trei șoareci). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografii electronice de transmisie reprezentative ale PN-urilor secțiunilor cerebeloase Mfn2cKO transduse cu vectorii virali indicați. Masca roz ilustrează zona ocupată de dendrite, iar pătratul punctat galben ilustrează zoom-ul din dreapta; n reprezintă nucleul. Bara de scală, 1 μm. (E) prezintă un exemplu de colorare PCx în PN transdusă la 12 săptămâni. Bara de scală, 20 μm. OE, supraexprimare; FC, modificarea de pliere.
În cele din urmă, am investigat importanța supraviețuirii celulare induse de peroxidază în PN care au prezentat disfuncție OXPHOS. Am generat mCherry care codifică AAV-shRNA (ARN scurt în ac de păr) care vizează în mod specific ARNm PCx de șoarece (AAV-shPCx) și am injectat virusul sau controlul său amestecat (AAV-scr) în cerebelul șoarecilor Mfn2cKO. Injecția a fost efectuată la vârsta de a patra săptămână (Figura 5A) pentru a obține o reducere eficientă a PCx în perioada în care expresia PCx a crescut (Figura 3C) și stratul celular PN era încă intact (Figura 1A). Este demn de remarcat faptul că reducerea PCx (Figura S8A) duce la o accelerare semnificativă a morții PN, care este limitată la inelul infectat (Figura 5, B și C). Pentru a înțelege mecanismul efectelor metabolice induse de creșterea expresiei PCx, am studiat starea redox a neuronilor paralitici (PN) după inhibarea expresiei PCx și exprimarea simultană a biosenzorului optic Grx1-roGFP2 mediat de AAV (Figura S8, B până la D) pentru a evalua modificarea relativă a potențialului redox al peptidei glutation (38). Apoi, am efectuat microscopie imagistică cu fluorescență pe durata vieții cu doi fotoni (FLIM) în secțiuni acute de creier de la Mfn2cKO în vârstă de 7 săptămâni sau de la copii de control pentru a detecta potențiale modificări ale stării redox citoplasmatice după verificarea condițiilor FLIM (Figura S8, E până la G). Analiza a arătat o creștere semnificativă a stării de oxidare a unei singure PN Mfn2cKO cărora le lipsește expresia PCx, ceea ce este diferit de neuronii de control sau PN Mfn2cKO care exprimă doar shRNA amestecat (Figura 5, D și E). Când expresia PCx a fost reglată negativ, procentul de PN Mfn2cKO care prezintă o stare puternic oxidată a crescut de peste trei ori (Figura 5E), indicând faptul că reglarea în sus a PCx a menținut capacitatea redox a neuronilor degenerați.
(A) O schemă care prezintă programul experimental pentru injectarea AAV care codifică shPCx atunci când este activată calea metabolică indicată. (B) Fotografii confocale reprezentative ale secțiunilor cerebeloase în vârstă de 8 săptămâni la șoareci Mfn2cKO transduși și marcați cu anticorp anti-calcineurină la 4 săptămâni. Bara de scală, 450 μm. (C) Cuantificarea densității celulelor Purkinje în buclele transduse cu AAV (analiză unidirecțională a varianței; n = 3 până la 4 șoareci). Datele sunt exprimate ca medie ± SEM; ***P < 0,001. (D) Imaginea FLIM reprezentativă arată durata medie de viață a senzorului redox de glutation Grx1-roGFP2 care exprimă PN în vârstă de 7 săptămâni în condițiile experimentale specificate. Raportul LUT (tabel de căutare): intervalul de timp de supraviețuire (în picosecunde). Bara de scală, 25 μm. (E) Histograma prezintă distribuția valorilor duratei de viață a Grx1-roGFP2 din (D) (n=158 până la 368 de celule la doi șoareci în fiecare condiție). Diagrama circulară de deasupra fiecărei histograme arată numărul de celule cu valori ale duratei de viață semnificativ mai lungi (roșu, oxidat) sau mai scurte (albastru, redus), care depășesc 1 DS din valoarea medie a duratei de viață în CTRL-AAV-scr. (F) Modelul propus arată efectul protector al suprareglării PCx neuronale.
În concluzie, datele pe care le oferim aici arată că reexprimarea MFN2 poate vindeca complet neuropatia paralitică avansată cu deficit sever de OXPHOS, epuizare severă a ADNmt și morfologie extrem de anormală de tip ista, asigurând astfel un progres continuu chiar și în bolile avansate. Neurodegenerarea oferă dovezi reversibile ale stadiului dinaintea morții celulare. Acest grad de flexibilitate metabolică este subliniat în continuare de capacitatea neuronilor de a induce ateroscleroza (o recablare a ciclului TCA), care inhibă expresia PCx în neuropatiile paralitice cărora le lipsește OXPHOS și amplifică moartea celulară, jucând astfel un rol protector (Figura 5F).
În acest studiu, am furnizat dovezi că răspunsul neuronilor paralitici (PN) la disfuncția OXPHOS este de a converge treptat către ateroscleroza ciclului TCA prin calea de activare diferențială activată de programele metabolice. Am confirmat analiza proteomică cu numeroase metode complementare și am relevat că, atunci când sunt provocați de disfuncție mitocondrială severă, neuronii prezintă o formă de elasticitate metabolică necunoscută anterior. Spre surprinderea noastră, întregul proces de recablare nu marchează neapărat starea metabolică terminală care însoțește neurodegenerarea treptat și ireversibil, dar datele noastre sugerează că ar putea constitui un mecanism de compensare funcțională a neuronilor de întreținere chiar și în stadiul anterior morții celulare. Această constatare indică faptul că neuronii au un grad considerabil de plasticitate metabolică în organism. Acest fapt dovedește că reintroducerea ulterioară a MFN2 poate inversa expresia markerilor metabolici cheie și poate preveni degenerarea PN. Dimpotrivă, inhibă ateroscleroza și accelerează nervii transsexuali.
Una dintre cele mai fascinante descoperiri din cercetarea noastră este că neurotransmisoarele (PN) cărora le lipsește OXPHOS pot modifica metabolismul ciclului TCA prin reglarea în sus a enzimelor care stimulează în mod specific arterioscleroza. Rearanjarea metabolică este o caracteristică comună a celulelor canceroase, unele dintre ele bazându-se pe glutamină pentru a suplimenta intermediarii ciclului TCA în vederea producerii de echivalenți reducători, care declanșează lanțul respirator și mențin producția de precursori ai biosintezei lipidice și nucleotidice (39, 40). Un studiu recent a arătat că în țesuturile periferice care prezintă disfuncții OXPHOS, reconectarea metabolismului glutamină/glutamat este, de asemenea, o caracteristică proeminentă (5, 41), unde direcția de intrare a glutaminei în ciclul TCA depinde de severitatea leziunii OXPHOS (41). Cu toate acestea, există o lipsă de dovezi clare privind orice similaritate a plasticității metabolice neuronale în organism și posibila sa relevanță în contextul bolii. Într-un studiu recent in vitro, s-a demonstrat că neuronii corticali primari mobilizează rezervele de glutamat pentru neurotransmisie, promovând astfel metabolismul oxidativ și ateroscleroza în condiții de stres metabolic (42). Este demn de remarcat faptul că, sub inhibarea farmacologică a enzimei succinat dehidrogenază a ciclului TCA, se consideră că carboxilarea piruvatului menține sinteza oxaloacetatului în neuronii granulari cerebeloși cultivați (34). Cu toate acestea, relevanța fiziologică a acestor mecanisme pentru țesutul cerebral (unde se crede că ateroscleroza este limitată în principal la astrocite) are încă o semnificație fiziologică importantă (43). În acest caz, datele noastre arată că PN deteriorate de OXPHOS în organism pot fi comutate la degradarea BCAA și carboxilarea piruvatului, care sunt cele două surse principale de suplimentare a intermediarilor din pool-ul TCA. Deși a fost propusă presupusa contribuție a catabolismului BCAA la metabolismul energetic neuronal, pe lângă rolul glutamatului și GABA pentru neurotransmisie (44), încă nu există dovezi pentru aceste mecanisme in vivo. Prin urmare, este ușor de speculat că PN disfuncționale pot compensa automat consumul de intermediari TCA determinat de procesul de asimilare prin creșterea aterosclerozei. În special, suprareglarea PCx poate fi necesară pentru a menține o cerere crescută de acid aspartic, ceea ce este sugerat în celulele proliferative cu disfuncție mitocondrială (45). Cu toate acestea, analiza noastră metabolomică nu a relevat nicio modificare semnificativă a nivelului de acid aspartic în starea de echilibru în neuronii parodontali (PN) Mfn2cKO (Figura S6A), ceea ce reflectă probabil utilizarea metabolică diferită a acidului aspartic între celulele proliferative și neuronii post-mitotici. Deși mecanismul exact al suprareglării PCx în neuronii disfuncționali in vivo rămâne de caracterizat, am demonstrat că acest răspuns prematur joacă un rol important în menținerea stării redox a neuronilor, ceea ce a fost demonstrat în experimente FLIM pe secțiuni cerebeloase. În special, împiedicarea PN să supraregleze PCx poate duce la o stare mai oxidată și poate accelera moartea celulară. Activarea degradării BCAA și carboxilarea piruvatului nu sunt modalități de a caracteriza țesuturile periferice cu disfuncție mitocondrială (7). Prin urmare, acestea par a fi o caracteristică prioritară a neuronilor cu deficit de OXPHOS, chiar dacă nu singura caracteristică, care este importantă pentru neurodegenerare. .
Boala cerebeloasă este un tip eterogen de boală neurodegenerativă care se manifestă de obicei ca ataxie și adesea afectează NP (46). Această populație de neuroni este deosebit de vulnerabilă la disfuncția mitocondrială, deoarece degenerarea lor selectivă la șoareci este suficientă pentru a reproduce multe dintre simptomele motorii care caracterizează ataxia spinocerebeloasă umană (16, 47, 48). Conform rapoartelor, un model transgenic de șoarece cu o genă mutantă este asociat cu ataxia spinocerebeloasă umană și prezintă disfuncție mitocondrială (49, 50), subliniind importanța studierii consecințelor deficitului de OXPHOS în PNPH. Prin urmare, este deosebit de potrivit să se izoleze și să se studieze eficient această populație unică de neuroni. Cu toate acestea, având în vedere că NP sunt foarte sensibile la presiune și reprezintă o proporție mică din întreaga populație de celule cerebeloase, pentru multe studii bazate pe omică, separarea selectivă a acestora ca celule întregi este încă un aspect dificil. Deși este aproape imposibil să se obțină lipsa absolută a contaminării altor tipuri de celule (în special a țesuturilor adulte), am combinat o etapă eficientă de disociere cu FACS pentru a obține un număr suficient de neuroni viabili pentru analiza proteomică ulterioară și am avut o acoperire proteică destul de ridicată (aproximativ 3000 de proteine) în comparație cu setul de date existent al întregului cerebel (51). Prin păstrarea viabilității celulelor întregi, metoda pe care o oferim aici ne permite nu numai să verificăm modificările căilor metabolice din mitocondrii, ci și să verificăm modificările omologilor lor citoplasmatici, ceea ce completează utilizarea etichetelor membranei mitocondriale pentru îmbogățirea tipului de celule. Noua metodă pentru numărul de mitocondrii în țesuturile complexe (52, 53). Metoda pe care o descriem nu este legată doar de studiul celulelor Purkinje, ci poate fi aplicată cu ușurință oricărui tip de celulă pentru a aborda modificările metabolice din creierele bolnave, inclusiv alte modele de disfuncție mitocondrială.
În cele din urmă, am identificat o fereastră terapeutică în timpul acestui proces de rearanjare metabolică, care poate inversa complet semnele cheie ale stresului celular și poate preveni degenerarea neuronală. Prin urmare, înțelegerea implicațiilor funcționale ale re-cablării descrise aici poate oferi perspective fundamentale asupra posibilelor tratamente pentru menținerea viabilității neuronale în timpul disfuncției mitocondriale. Sunt necesare cercetări viitoare care vizează disecarea modificărilor metabolismului energetic în alte tipuri de celule cerebrale pentru a dezvălui pe deplin aplicabilitatea acestui principiu la alte boli neurologice.
Șoarecii MitoPark au fost descriși anterior (31). Șoarecii C57BL/6N cu gene Mfn2 flancante cu loxP au fost descriși anterior (18) și încrucișați cu șoareci L7-Cre (23). Descendenții dublu heterozigoți rezultați au fost apoi încrucișați cu șoareci homozigoți Mfn2loxP/Mfn2loxP pentru a genera gene knockout specifice Purkinje pentru Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Într-un subset de împerechere, alela Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) a fost introdusă prin încrucișări suplimentare (20). Toate procedurile pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile europene, naționale și instituționale și aprobate de LandesamtfürNatur din Umwelt și Verbraucherschutz, Renania de Nord-Westfalia, Germania. Lucrările pe animale respectă, de asemenea, îndrumările Federației Europene a Asociațiilor de Științe ale Animalelor de Laborator.
După anestezia dislocării cervicale a femeii însărcinate, embrionul de șoarece este izolat (E13). Cortexul a fost disecat în Soluție Salină Echilibrată Hanks (HBSS) suplimentată cu 10 mM Hepes și trecut pe Mediu Eagle Modificat Dulbecco conținând papaină (20 U/ml) și cisteină (1 μg/ml). Țesutul se incubează în DMEM (Ml) și se disociază prin digestie enzimatică la 37°C timp de 20 de minute, apoi se măcinează mecanic în DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin. Celulele au fost însămânțate pe lamele de sticlă acoperite cu polilizină la o densitate de 2×10⁶ per placă de cultură de 6 cm sau la o densitate de 0,5×10⁶ celule/cm² pentru analiza imagistică. După 4 ore, mediul a fost înlocuit cu mediu Neurobasal fără ser conținând 1% supliment B27 și 0,5 mM GlutaMax. Neuronii au fost apoi menținuți la 37°C și 5% CO2 pe tot parcursul experimentului și hrăniți o dată pe săptămână. Pentru a induce recombinarea in vitro, s-au utilizat 3 μl (placă de cultură cu 24 de godeuri) sau 0,5 μl (placă cu 24 de godeuri) din următorul vector viral AAV9 pentru a trata neuronii în a doua zi in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, număr de catalog 105530-AAV9) și AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, număr de catalog 105545-AAV9).
ADN-ul complementar Mfn1 și Mfn2 de șoarece (obținut din plasmida Addgene #23212 și respectiv #23213) este marcat cu secvența V5 (GKPINPLLGLDST) la capătul C-terminal și este fuzionat cu mCherry în cadru prin secvența T2A. Grx1-roGFP2 este o donație de la Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Prin înlocuirea casetei tdTomato folosind metode convenționale de clonare, caseta a fost subclonată în catena principală pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (număr de referință Addgene 28306) pentru a genera vectorii pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 și pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. O strategie similară a fost utilizată pentru generarea vectorului de control pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pentru a genera constructul AAV-shPCx, este necesar un vector plasmidic AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), care conține secvența de ADN care codifică shRNA-ul care vizează PCx-ul de șoarece (5′CTTTCGCTCTAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Sub controlul promotorului U6, mCherry este utilizat sub controlul promotorului CMV. Producerea vectorilor AAV auxiliari a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului (Cell Biolabs). Pe scurt, se utilizează o plasmidă de transfer care transportă gena mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) pentru transfecția tranzitorie a celulelor 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) sau Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), precum și care codifică proteina capsidei AAV1 și proteina accesorie. Plasmida de ambalare a proteinei, utilizând metoda fosfatului de calciu. Supernatantul brut al virusului a fost obținut prin cicluri de congelare-decongelare într-o baie de gheață carbonică/etanol, iar celulele au fost lizate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Vectorul AAV a fost purificat prin ultracentrifugare discontinuă în gradient de iodixanol (24 de ore la 32.000 rpm și 4°C) și concentrat folosind un filtru centrifugal Amicon ultra-15. Titrul genomului AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copii genomice (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX a fost așa cum s-a descris anterior (54), măsurat prin PCR cantitativă în timp real (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) și AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Neuronii primari au fost răzuiți în PBS 1x rece ca gheața, peletizați și apoi omogenizați în tampon de liză 0,5% Triton X-100 / 0,5% deoxicolat de sodiu/PBS conținând fosfatază și inhibitor de protează (Roche). Cuantificarea proteinelor a fost efectuată utilizând testul cu acid bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Proteinele au fost apoi separate prin electroforeză pe gel de SDS-poliacrilamidă și apoi transferate pe o membrană de fluorură de poliviniliden (GE Healthcare). Blocați situsurile nespecifice și incubați cu anticorpul primar (vezi Tabelul S1 pentru detalii) în lapte 5% în TBST (soluție salină tamponată cu Tris cu Tween), etapele de spălare și anticorpul secundar în incubat TBST. Incubați cu anticorpul primar peste noapte la +4°C. După spălare, aplicați anticorpul secundar timp de 2 ore la temperatura camerei. Ulterior, prin incubarea aceluiași blot cu un anticorp anti-β-actină, s-a confirmat aceeași încărcare. Detectare prin conversia în chemiluminescență și amplificarea chemiluminescenței (GE Healthcare).
Neuronii însămânțați anterior pe lamele de sticlă au fost fixați cu 4% paraformaldehidă (PFA)/PBS la momentul specificat, la temperatura camerei, timp de 10 minute. Lamelele sunt mai întâi permeate cu 0,1% Triton X-100/PBS timp de 5 minute la temperatura camerei, apoi în tampon de blocare [3% albumină serică bovină (BSA)/PBS]. În a doua zi, lamelele au fost spălate cu tampon de blocare și incubate cu anticorpul secundar conjugat cu fluorofor corespunzător timp de 2 ore la temperatura camerei; în final, probele au fost spălate bine în PBS cu 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), contracolorate și apoi fixate pe lama de microscop cu Aqua-Poly/Mount.
Șoarecii (masculi și femele) au fost anesteziați prin injectare intraperitoneală de ketamină (130 mg/kg) și xilazină (10 mg/kg) și li s-a administrat subcutanat analgezic ibuprofen (5 mg/kg) și plasați într-un instrument stereotactic (Kopf) echipat cu o compresă caldă. Se expune craniul și se folosește un burghiu dentar pentru a subția partea cortexului cerebelos corespunzătoare osului lambda (de la lambda: coada 1,8, lateralul 1, corespunzător lobulilor IV și V). Se folosește un ac de seringă curbat pentru a crea cu grijă o mică gaură în craniu, pentru a evita perturbarea vascularizației de dedesubt. Apoi, capilarul subțire de sticlă este introdus lent în micro-gaura (de la -1,3 la -1 pe partea ventrală a durei mater) și se injectează 200 până la 300 nl de AAV în micro-injector (Narishige) cu seringi manuale (Narishige) de mai multe ori la presiune scăzută, pe o perioadă de timp de 10 până la 20 de minute. După perfuzie, se introduce capilarul în interior pentru încă 10 minute pentru a permite virusului să se răspândească complet. După ce capilarele sunt retrase, pielea este suturată cu atenție pentru a minimiza inflamația plăgii și a permite animalului să se recupereze. Animalele au fost tratate cu analgezice (caspofen) timp de câteva zile după operație, timp în care starea lor fizică a fost monitorizată cu atenție, iar apoi au fost eutanasiate la momentul stabilit. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu ghidurile europene, naționale și instituționale și au fost aprobate de LandesamtfürNatur din Umwelt și Verbraucherschutz, Renania de Nord-Westfalia, Germania.
Animalele au fost anesteziate cu ketamină (100 mg/kg) și xilazină (10 mg/kg), iar inima a fost perfuzată mai întâi cu PBS 0,1 M, apoi cu PFA 4% în PBS. Țesutul a fost disecat și fixat în PFA/PBS 4% peste noapte la 4°C. Un cuțit vibrator (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) a fost utilizat pentru a prepara secțiuni sagitale (grosime de 50 μm) din creierul fixat în PBS. Cu excepția cazului în care se specifică altfel, colorarea secțiunilor plutitoare a fost efectuată așa cum este descris mai sus (13) la temperatura camerei și sub agitare. Pe scurt, mai întâi, feliile obținute au fost permeabilizate cu Triton X-100/PBS 0,5% timp de 15 minute la temperatura camerei; pentru unii epitopi (Pcx și Shmt2), prin încălzirea feliilor timp de 25 de minute în tampon tris-EDTA la 80°C (PH 9) în loc de această etapă. Apoi, secțiunile au fost incubate peste noapte cu anticorp primar (vezi Tabelul S1) în tampon de blocare (3% BSA/PBS) la 4°C, sub agitare. A doua zi, secțiunile au fost spălate cu tampon de blocare și incubate cu anticorpul secundar conjugat cu fluorofor corespunzător timp de 2 ore la temperatura camerei; în final, secțiunile au fost spălate bine în PBS, contra-colorate cu DAPI și apoi fixate cu AquaPolymount pe o lamă de microscop.
Pentru imagistica probei s-a utilizat un microscop confocal cu scanare laser (TCS SP8-X sau TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) echipat cu un laser cu lumină albă și un laser ultraviolet cu 405 diode. Prin excitarea fluoroforului și colectarea semnalului cu un detector hibrid (HyDs), software-ul LAS-X a fost utilizat pentru a colecta imagini stivuite conforme cu eșantionarea Nyquist în mod secvențial: pentru panouri necantitative, este vorba de semnale extrem de dinamice (de exemplu, în celule somatice și dendrite) (mtYFP). Se utilizează HyD pentru a detecta numărul de particule particulare în modul BrightR). Se aplică o pornire de la 0,3 la 6 ns pentru a reduce fundalul.
Imagistica în timp real a celulelor sortate. După sortarea în mediu Neurobasal-A conținând 1% supliment de B27 și 0,5 mM GlutaMax, celulele au fost imediat însămânțate pe lame de sticlă acoperite cu poli-l-lizină (μ-Slide8 Well, Ibidi, număr de catalog 80826), apoi menținute la 37°C și 5% CO2 timp de 1 oră pentru a permite celulelor să se stabilizeze. Imagistica în timp real a fost efectuată pe un microscop confocal cu scanare laser Leica SP8, echipat cu laser alb, HyD, obiectiv cu ulei de 63×[apertura numerică (NA)] și o treaptă de încălzire.
Șoarecele a fost rapid anesteziat cu dioxid de carbon și decapitat, creierul a fost rapid îndepărtat din craniu și tăiat în secțiuni sagitale cu grosimea de 200 μm (pentru experimentul de marcare cu 13C) sau 275 μm (pentru experimentele cu doi fotoni) umplute cu următoarele materiale. Înghețata (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) este umplută cu următoarele substanțe: 125 mM lichid cefalorahidian artificial (ACSF) cu conținut scăzut de Ca2, saturat cu carbon (95% O2 și 5% CO2), rece ca gheața, NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat de sodiu, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucoză, 0,5 mM CaCl2 și 3,5 mM MgCl2 (presiune osmotică de 310 până la 330 mmol). Transferați feliile de creier obținute într-o cameră de pre-incubare care conține mediu cu concentrații mai mari de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat de sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucoză, 1,0 mM CaCl2 și 2,0 mM MgCl2), pH 7,4 și 310 până la 320 mmol.
În timpul procesului de imagistică, secțiunile au fost mutate într-o cameră dedicată de imagistică, iar experimentul a fost efectuat sub perfuzie continuă ACSF la o temperatură constantă de 32° până la 33°C. Pentru imagistica secțiunilor s-a utilizat un microscop cu scanare laser multifotonică (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) echipat cu un obiectiv Leica 25x (NA 0.95, apă) și un laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent). Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM al Grx1-roGFP2. Modificările stării redox citoplasmatice a PN-urilor au fost măsurate prin FLIM cu doi fotoni în secțiuni sagitale ale creierului, unde biosenzorul Grx1-roGFP2 a vizat PN-urile. În stratul PN, câmpul de achiziție este selectat la aproximativ 50 până la 80 μm sub suprafața secțiunii pentru a se asigura că există un PN viabil (adică lipsa structurii perlate sau a modificărilor morfologice neuronale de-a lungul dendritelor) și senzorul roGFP2 dublu pozitiv și AAV care codifică shRNA PCx sau secvența sa de control (fiecare coexprimând mCherry). Colectați imagini single-stack cu zoom digital 2x [lungime de undă de excitație: 890 nm; 512 nm 512 pixeli]. Detectare: HyD intern, grup de filtru izotiocianat de fluoresceină (FITC)] și medierea imaginilor în 2 până la 3 minute sunt utilizate pentru a se asigura că sunt colectați suficienți fotoni (1000 de fotoni în total) pentru ajustarea curbei. Sensibilitatea sondei Grx1-roGFP2 și verificarea condițiilor FLIM au fost efectuate prin monitorizarea valorii duratei de viață a roGFP2 la adăugarea de 10 mM H2O2 exogen la ACSF-ul de perfuzie (pentru a maximiza oxidarea, rezultând o durată de viață crescută), și apoi adăugarea de 2 mM ditiotreitol (minimizează gradul de reducere, rezultând o scădere a duratei de viață) (Figura S8, D până la G). S-a utilizat software-ul FLIMfit 5.1.1 pentru a analiza rezultatele obținute, a ajusta curba de descreștere exponențială unică a întregii imagini la IRF-ul măsurat (funcția de răspuns a instrumentului), iar χ2 este de aproximativ 1. Pentru a calcula durata de viață a unei singure neuropatii partiale (PN), masca din jurul corpului nervului a fost desenată manual, iar durata de viață medie în fiecare mască a fost utilizată pentru cuantificare.
Analiza potențialului mitocondrial. După ce secțiunea acută a fost incubată cu 100 nM TMRM adăugat direct în ACSF perfuzat timp de 30 de minute, modificările potențialului mitocondrial al PN-urilor au fost măsurate cu un microscop cu doi fotoni. Imagistica TMRM a fost efectuată prin excitarea sondei la 920 nm și utilizarea HyD internă (izotiocianat de tetrametilrodamină: 585/40 nm) pentru colectarea semnalelor; utilizând aceeași lungime de undă de excitație, dar un HyD intern diferit (FITC: 525/50) pentru a imagistica mtYFP. Utilizați pluginul Image Calculator al ImageJ pentru a evalua potențialul mitocondrial la nivel de celulă individuală. Pe scurt, ecuația pluginului: semnal = min (mtYFP, TMRM) este utilizată pentru a identifica regiunea mitocondrială care prezintă semnalul TMRM în Purkinje Somali în imaginea confocală single-stack a canalului corespunzător. Apoi, aria pixelilor din masca rezultată este cuantificată și apoi normalizată pe imaginea cu prag unic corespunzător a canalului mtYFP pentru a obține fracția mitocondrială care prezintă potențialul mitocondrial.
Imaginea a fost deconvoluată cu ajutorul software-ului Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Pentru imaginile scanate ale plăcilor, montajul unei singure plăci este realizat folosind algoritmul automat de îmbinare furnizat de software-ul LAS-X. După calibrarea imaginii, se utilizează ImageJ și Adobe Photoshop pentru a procesa imaginea și a ajusta uniform luminozitatea și contrastul. Se utilizează Adobe Illustrator pentru pregătirea grafică.
Analiza focalizării ADNmt. Numărul de leziuni ale ADNmt a fost cuantificat pe secțiuni cerebeloase marcate cu anticorpi împotriva ADN-ului prin microscop confocal. Fiecare zonă țintă a fost creată pentru corpul celular și nucleul fiecărei celule, iar aria respectivă a fost calculată folosind pluginul Multi Measure (software-ul ImageJ). Scădeți aria nucleară din aria corpului celular pentru a obține aria citoplasmatică. În final, pluginul Analyze Particles (software-ul ImageJ) a fost utilizat pentru a cuantifica automat punctele de ADN citoplasmatic care indică ADNmt pe imaginea prag, iar rezultatele obținute au fost normalizate la media PN a șoarecilor CTRL. Rezultatele sunt exprimate ca număr mediu de nucleozide per celulă.
Analiza expresiei proteinelor. Folosiți pluginul Image Calculator de la ImageJ pentru a evalua expresia proteinelor în PN la nivel de celulă individuală. Pe scurt, în imaginea confocală cu un singur strat a canalului corespunzător, prin ecuația: semnal = min (mtYFP, anticorp), este identificată regiunea mitocondrială care prezintă imunoreactivitate la un anumit anticorp din Purkina. Apoi, aria pixelilor din masca rezultată este cuantificată și apoi normalizată pe imaginea cu prag unic corespunzător a canalului mtYFP pentru a obține fracția mitocondrială a proteinei afișate.
Analiza densității celulelor Purkinje. Pluginul Cell Counter din ImageJ a fost utilizat pentru a evalua densitatea Purkinje prin împărțirea numărului de celule Purkinje numărate la lungimea inelului cerebelos ocupat de celulele numărate.
Pregătirea și recoltarea probelor. Creierele din grupul de control și șoarecii Mfn2cKO au fost fixate în 2% PFA/2,5% glutaraldehidă în tampon fosfat (PB) 0,1 M, iar apoi s-au preparat secțiuni coronale folosind ciliați (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (grosime 50 până la 60 μm). Apoi, s-au fixat în tampon PB în 1% tetraoxid de os și 1,5% ferocianură de potasiu la temperatura camerei timp de 1 oră. Secțiunile au fost spălate de trei ori cu apă distilată și apoi colorate cu etanol 70% conținând 1% acetat de uranil timp de 20 de minute. Secțiunile au fost apoi deshidratate în alcool gradat și încorporate în rășină epoxidică Durcupan ACM (rășină de turnare Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, număr de catalog 14040) între lame de sticlă acoperite cu silicon și, în final, la 60°C, s-au polimerizat în cuptor timp de 48 de ore. Zona cortexului cerebelos a fost selectată și secțiuni ultrafin de 50 nm au fost tăiate cu Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) și preluate pe o grilă cu fantă de cupru de 2×1 mm acoperită cu folie de polistiren. Secțiunile au fost colorate cu o soluție de acetat de uranil 4% în H2O timp de 10 minute, spălate cu H2O de mai multe ori, apoi cu citrat de plumb Reynolds în H2O timp de 10 minute și apoi spălate cu H2O de mai multe ori. Micrografiile au fost realizate cu un microscop electronic cu transmisie Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) utilizând o cameră digitală TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, SUA). Germania.
Pentru șoarecii infectați cu AAV, creierul a fost separat și secționat într-o secțiune sagitală cu grosimea de 1 mm, iar cerebelul a fost examinat folosind un microscop cu fluorescență pentru a identifica inelul infectat cu AAV (adică, care exprimă mCherry). Se utilizează doar experimentele în care injectarea de AAV are ca rezultat o eficiență de transducție foarte mare a stratului de celule Purkinje (adică aproape întregul strat) în cel puțin două inele cerebeloase consecutive. Bucla transdusă cu AAV a fost microdisecată pentru post-fixare peste noapte (4% PFA și 2,5% glutaraldehidă în tampon cocoat 0,1 M) și procesată ulterior. Pentru încorporarea EPON, țesutul fixat a fost spălat cu tampon cocoat de sodiu 0,1 M (Applichem) și incubat cu 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) în tampon cocoat de sodiu 0,1 M (Applichem) timp de 4 ore, apoi spălat timp de 2 ore. Se repetă de 3 ori cu tampon cocamidă 0,1 M. Ulterior, seria ascendentă de etanol a fost utilizată pentru a incuba fiecare soluție de etanol la 4°C timp de 15 minute pentru a deshidrata țesutul. Țesutul a fost transferat în oxid de propilenă și incubat peste noapte în EPON (Sigma-Aldrich) la 4°C. Țesutul a fost plasat în EPON proaspăt la temperatura camerei timp de 2 ore, apoi încorporat la 62°C timp de 72 de ore. Se utilizează un ultramicrotom (Leica Microsystems, UC6) și un cuțit diamantat (Diatome, Biel, Elveția) pentru a tăia secțiuni ultrafin de 70 nm și se colorează cu acetat de uranil 1,5% timp de 15 minute la 37°C și se colorează cu soluție de citrat de plumb timp de 4 minute. Micrografiile electronice au fost realizate utilizând un microscop electronic de transmisie (JEOL) JEM-2100 Plus echipat cu Camera OneView 4K pe 16 biți (Gatan) și software-ul DigitalMicrograph (Gatan). Pentru analiză, micrografiile electronice au fost achiziționate cu zoom digital de 5000× sau 10.000×.
Analiza morfologică a mitocondriilor. Pentru toate analizele, contururile mitocondriilor individuale au fost conturate manual în imagini digitale folosind software-ul ImageJ. Sunt analizați diferiți parametri morfologici. Densitatea mitocondrială este exprimată ca procent, obținut prin împărțirea ariei mitocondriale totale a fiecărei celule la aria citoplasmei (aria citoplasmei = aria celulei - aria nucleului celulei) × 100. Rotunjimea mitocondriilor este calculată cu formula [4π∙(arie/perimetru 2)]. Morfologia mitocondriilor a fost analizată și împărțită în două categorii („tubulară” și „veziculară”) în funcție de formele lor principale.
Analiza numărului și densității autofagozomilor/lizozomilor. Se utilizează software-ul ImageJ pentru a contura manual contururile fiecărui autofagozom/lizozom în imaginea digitală. Aria autofagozomilor/lizozomilor este exprimată ca procent, calculat prin împărțirea ariei totale a structurii autofagozomilor/lizozomilor fiecărei celule la aria citoplasmei (aria citoplasmei = aria celulei - aria nucleului) × 100. Densitatea autofagozomilor/lizozomilor se calculează prin împărțirea numărului total la numărul de structuri autofagozomilor/lizozomilor per celulă (în termeni de aria citoplasmatică) (aria citoplasmatică = aria celulei - aria nucleului).
Etichetarea pentru secționarea acută și prepararea probei. Pentru experimentele care necesită marcare cu glucoză, transferați feliile de creier acute într-o cameră de pre-incubare, care conține carbon saturat (95% O2 și 5% CO2), ACSF cu conținut ridicat de Ca2 + (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat de sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucoză, 1,0 mM CaCl2 și 2,0 mM MgCl2, ajustat la pH 7,4 și 310 până la 320 mOsm), în care glucoza este substituită cu 13C6-glucoză (Eurisotop, număr de catalog CLM-1396). Pentru experimentele care necesită marcare cu piruvat, se transferă secțiunile de creier acute într-o soluție mai mare de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat de sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucoză, 1,0 mM CaCl2 și se adaugă 2,0 mM MgCl2, se ajustează pH-ul la 7,4 și 310 până la 320 mOsm) și se adaugă 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, număr de catalog CLM-1082). Se incubează secțiunile timp de 90 de minute la 37°C. La sfârșitul experimentului, secțiunile au fost spălate rapid cu o soluție apoasă (pH 7,4) conținând 75 mM carbonat de amoniu și apoi omogenizate în acetonitril (ACN):metanol:apă 40:40:20 (v:v:v) . După ce secțiunile au fost incubate pe gheață timp de 30 de minute, probele au fost centrifugate la 21.000 g timp de 10 minute la 4°C, iar supernatantul limpede a fost uscat într-un concentrator SpeedVac. Peleta de metabolit uscat rezultată a fost depozitată la -80°C până la analiză.
Analiza prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă a aminoacizilor marcați cu 13C. Pentru analiza prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS), peleta de metabolit a fost resuspendată în 75 μl de apă de calitate LC-MS (Honeywell). După centrifugare la 21.000 g timp de 5 minute la 4°C, 20 μl din supernatantul clarificat au fost utilizați pentru analiza fluxului de aminoacizi, în timp ce restul extractului a fost utilizat imediat pentru analiza anionilor (vezi mai jos). Analiza aminoacizilor a fost efectuată utilizând protocolul de derivatizare a clorurii de benzoil descris anterior (55, 56). În prima etapă, 10 μl de carbonat de sodiu 100 mM (Sigma-Aldrich) au fost adăugați la 20 μl de extract de metabolit, iar apoi 10 μl de clorură de benzoil 2% (Sigma-Aldrich) au fost adăugați la ACN de calitate LC. Proba a fost vortexată scurt și apoi centrifugată la 21.000 g timp de 5 minute la 20°C. Se transferă supernatantul limpezit într-un flacon de autosampler de 2 ml cu insert conic din sticlă (volum de 200 μl). Probele au fost analizate utilizând sistemul LC de ultra-înaltă performanță Acquity iClass (Waters) conectat la spectrometrul de masă de precizie de înaltă rezoluție Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Pentru analiză, 2 μl din proba derivatizată au fost injectați într-o coloană de silice T3 de înaltă rezistență de 100×1,0 mm (Waters) conținând particule de 1,8 μm. Debitul este de 100 μl/min, iar sistemul tampon este format din tamponul A (10 mM formiat de amoniu și 0,15% acid formic în apă) și tamponul B (ACN). Gradientul este următorul: 0%B la 0 minute; 0%B. 0 până la 15% B la 0 până la 0,1 minute; 15 până la 17% B la 0,1 până la 0,5 minute; B la 17 până la 55% la 0,5 până la 14 minute; B la 55 până la 70% la 14 până la 14,5 minute; la 14,5 până la 70 până la 100% B la 18 minute; 100% B la 18 până la 19 minute; 100 până la 0% B la 19 până la 19,1 minute; 0% B la 19,1 până la 28 de minute (55, 56). Spectrometrul de masă QE-HF funcționează în mod de ionizare pozitivă cu un interval de masă m/z (raport masă/sarcină) de la 50 la 750. Rezoluția aplicată este de 60.000, iar ținta ionică de control al amplificării (AGC) obținută este de 3×10⁶, iar timpul maxim de ionizare este de 100 de milisecunde. Sursa de ionizare prin electropulverizare încălzită (ESI) funcționează la o tensiune de pulverizare de 3,5 kV, o temperatură capilară de 250°C, un flux de aer în teacă de 60 UA (unități arbitrare) și un flux de aer auxiliar de 20 UA la 250°C. Lentila S este setată la 60 UA.
Analiza prin cromatografie anionica-MS a acizilor organici marcați cu 13C. Precipitatul de metabolit rămas (55 μl) a fost analizat utilizând un sistem de cromatografie ionică Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) conectat la un spectrometru de masă QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Pe scurt, 5 μl de extract de metabolit au fost injectați într-o coloană Dionex IonPac AS11-HC echipată cu HPLC (2 mm × 250 mm, dimensiunea particulelor 4 μm, Thermo Fisher Scientific) în mod de buclă parțială push-in cu un raport de umplere de 1.) Coloană de gardă Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Temperatura coloanei este menținută la 30°C, iar autosamplerul este setat la 6°C. Se utilizează o cartușă de hidroxid de potasiu prevăzută cu apă deionizată pentru a genera un gradient de hidroxid de potasiu prin generatorul de eluent. Separarea metaboliților la un debit de 380 μl/min, aplicând următorul gradient: 0 până la 3 minute, 10 mM KOH; 3 până la 12 minute, 10 până la 50 mM KOH; 12 până la 19 minute, 50 până la 100 mM KOH; 19 până la 21 minute, 100 mM KOH; 21 până la 21,5 minute, 100 până la 10 mM KOH. Coloana a fost reechilibrată sub 10 mM KOH timp de 8,5 minute.
Metaboliții eluați sunt combinați cu un flux suplimentar de izopropanol de 150 μl/min după coloană și apoi direcționați către un spectrometru de masă de înaltă rezoluție care funcționează în mod de ionizare negativă. MS monitorizează intervalul de masă de la m/z 50 la 750 cu o rezoluție de 60.000. AGC-ul este setat la 1×106, iar timpul maxim de ioni este menținut la 100 ms. Sursa ESI încălzită a funcționat la o tensiune de pulverizare de 3,5 kV. Celelalte setări ale sursei de ioni sunt următoarele: temperatura capilară 275°C; debitul de gaz în teacă, 60 AU; debitul de gaz auxiliar, 20 AU la 300°C și setarea lentilei S la 60 AU.
Analiza datelor metaboliților marcați cu 13C. S-a utilizat software-ul TraceFinder (versiunea 4.2, Thermo Fisher Scientific) pentru analiza datelor privind raportul izotopic. Identitatea fiecărui compus a fost verificată cu un compus de referință fiabil și analizată independent. Pentru a efectua analiza îmbogățirii izotopice, aria cromatogramei ionilor extrași (XIC) a fiecărui izotop 13C (Mn) a fost extrasă din [M + H] +, unde n este numărul de atomi de carbon al compusului țintă, utilizat pentru analiza aminoacizilor sau [MH] + este utilizat pentru analiza anionilor. Precizia masei XIC este mai mică de cinci părți per milion, iar precizia timpului de reacție (RT) este de 0,05 minute. Analiza îmbogățirii se efectuează prin calcularea raportului dintre fiecare izotop detectat și suma tuturor izotopilor compusului corespunzător. Aceste rapoarte sunt date ca valori procentuale pentru fiecare izotop, iar rezultatele sunt exprimate ca procent molar de îmbogățire (MPE), așa cum s-a descris anterior (42).
Peleta de neuroni congelată a fost omogenizată în metanol 80% (v/v) răcit cu gheață, vortexată și incubată la -20°C timp de 30 de minute. Se vortexează din nou proba și se agită la +4°C timp de 30 de minute. Proba a fost centrifugată la 21.000 g timp de 5 minute la 4°C, iar apoi supernatantul rezultat a fost colectat și uscat folosind un concentrator SpeedVac la 25°C pentru analiza ulterioară. Așa cum s-a descris mai sus, analiza LC-MS a fost efectuată pe aminoacizii celulelor sortate. Folosind TraceFinder (versiunea 4.2, Thermo Fisher Scientific), analiza datelor a fost efectuată folosind masa monoizotopică a fiecărui compus. Normalizarea cuantilă a datelor metaboliților a fost efectuată folosind pachetul software preprocessCore (57).
Pregătirea feliilor. Șoarecele a fost anesteziat rapid cu dioxid de carbon și decapitat, creierul a fost îndepărtat rapid din craniu, iar cuțitul vibrator umplut cu gheață (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) a fost utilizat pentru a-l tăia în secțiuni sagitale de 300 până la 375 μm. Gazificare cu carbon rece (95% O2 și 5% CO2). Conținut scăzut de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, tampon fosfat de sodiu 1,25 mM, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucoză, 1,0 mM CaCl2 și 6,0 mM MgCl2. Ajustarea pH-ului la 7,4 și 310 până la 330 mOsm). Transferați feliile de creier obținute într-o cameră care conține o concentrație mai mare de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon fosfat de sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucoză, 4,0 mM CaCl2 și 3,5 mM MgCl2), pH 7,4 și 310 până la 320 mOsm. Depozitați feliile timp de 20 până la 30 de minute pentru a putea fi restaurate înainte de înregistrare.
Înregistrare. Pentru toate înregistrările s-a utilizat o platină de microscop echipată cu o cameră de înregistrare fixă ​​și un obiectiv cu imersie în apă de 20x (Scientifica). Celulele Purkinje presupuse au fost identificate după (i) dimensiunea corpului, (ii) localizarea anatomică a cerebelului și (iii) expresia genei reporter fluorescente mtYFP. Pipeta cu patch-uri, cu o rezistență la vârf de 5 până la 11 megaohmi, este extrasă de un capilar din sticlă borosilicată (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Germania) și o pipetă orizontală Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Toate înregistrările au fost efectuate cu amplificatorul cu clemă patch npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Germania), care a fost controlat de software-ul Signal (versiunea 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Marea Britanie). Experimentul a fost înregistrat la o rată de eșantionare de 12,5 kHz. Semnalul este filtrat cu două filtre Bessel cu trecere scurtă, cu frecvențe de tăiere de 1,3 și respectiv 10 kHz. Capacitatea membranei și a pipetei este compensată de circuitul de compensare utilizând amplificatorul. Toate experimentele au fost efectuate sub controlul unei camere Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germania), care a fost controlată de software-ul Hokawo (versiunea 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germania).
Configurarea și analiza de rutină a celulelor întregi. Imediat înainte de înregistrare, umpleți pipeta cu soluția internă care conține următoarele substanțe: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconat de potasiu, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanozin trifosfat (GTP) (Na) și 10,0 mM creatinină fosfat au fost ajustate la pH 7,25, iar presiunea osmotică a fost de 290 mOsm (zaharoză). Imediat după aplicarea unei forțe de 0 pA pentru a rupe membrana, a fost măsurat potențialul membranei de repaus. Rezistența de intrare este măsurată prin aplicarea unor curenți hiperpolarizați de -40, -30, -20 și -10 pA. Măsurați magnitudinea răspunsului la tensiune și utilizați legea lui Ohm pentru a calcula rezistența de intrare. Activitatea spontană a fost înregistrată într-un clește de tensiune timp de 5 minute, iar sPSC a fost identificat și măsurat în Igor Pro (versiunea 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, SUA) folosind un script de recunoaștere semiautomată. Curba IV și curentul în stare staționară sunt măsurate prin prinderea bateriei la diferite potențiale (începând de la -110 mV) și creșterea tensiunii în trepte de 5 mV. Producerea de AP a fost testată prin aplicarea unui curent de depolarizare. Fixați celula la -70 mV în timp ce aplicați un impuls de curent de depolarizare. Ajustați dimensiunea pasului fiecărei unități de înregistrare separat (10 până la 60 pA). Calculați frecvența maximă AP numărând manual vârfurile de impuls care provoacă cea mai mare frecvență AP. Pragul AP este analizat utilizând derivata a doua a impulsului de depolarizare care declanșează primul unul sau mai multe AP-uri.
Configurarea și analiza patch-ului perforat. Efectuați înregistrarea patch-ului perforat utilizând protocoale standard. Utilizați o pipetă fără ATP și GTP care nu conține următoarele ingrediente: 128 mM gluconat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA și 2 mM MgCl2 și ajustați pH-ul la 7,2 (folosind KOH). ATP și GTP sunt omise din soluția intracelulară pentru a preveni permeabilitatea necontrolată a membranei celulare. Pipeta patch este umplută cu o soluție internă care conține amfotericină (aproximativ 200 până la 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) pentru a obține o înregistrare a patch-ului perforat. Amfotericina a fost dizolvată în dimetilsulfoxid (concentrație finală: 0,1 până la 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Concentrația de DMSO utilizată nu a avut un efect semnificativ asupra neuronilor studiați. În timpul procesului de perforare, rezistența canalului (Ra) a fost monitorizată continuu, iar experimentul a început după stabilizarea amplitudinii Ra și a PA (20-40 de minute). Activitatea spontană este măsurată într-un clește de tensiune și/sau curent timp de 2 până la 5 minute. Analiza datelor a fost efectuată utilizând Igor Pro (versiunea 7.05.2, WaveMetrics, SUA), Excel (versiunea 2010, Microsoft Corporation, Redmond, SUA) și GraphPad Prism (versiunea 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA (Statele Unite). Pentru a identifica PA-urile spontane, se utilizează pluginul NeuroMatic v3.0c de la IgorPro. Identificați automat PA-urile folosind un prag dat, care este ajustat individual pentru fiecare înregistrare. Folosind intervalul de vârfuri, determinați frecvența vârfurilor cu frecvența maximă instantanee a vârfurilor și frecvența medie a vârfurilor.
Izolarea PN. Prin adaptarea protocolului publicat anterior, PN-urile au fost purificate din cerebelul șoarecelui într-un stadiu specificat (58). Pe scurt, cerebelul a fost disecat și tocat în mediu de disociere rece ca gheața [fără HBSS Ca2+ și Mg2+, suplimentat cu 20 mM glucoză, penicilină (50 U/ml) și streptomicină (0,05 mg/ml)], iar apoi mediul a fost digerat în papaină [HBSS, suplimentat cu 1-cisteină·HCl (1 mg/ml), papaină (16 U/ml) și dezoxiribonuclează I (DNază I; 0,1 mg/ml)]. Tratat timp de 30 de minute la 30°C. Mai întâi, se spală țesuturile în mediu HBSS conținând mucus de ou (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) și DNază (0,1 mg/ml) la temperatura camerei pentru a preveni digestia enzimatică, iar apoi în mediul HBSS conținând 20 mM glucoză. Măcinarea ușoară în HBSS a penicilinei (50 U/ml), streptomicinei (0,05 mg/ml) și DNazăi (0,1 mg/ml) eliberează celule individuale. Suspensia celulară rezultată a fost filtrată printr-o sită celulară de 70 μm, apoi celulele au fost peletate prin centrifugare (1110 rpm, 5 minute, 4°C) și resuspendate în mediu de sortare [HBSS, suplimentat cu 20 mM glucoză, 20% ser fetal bovin, penicilină (50 U/ml) și streptomicină (0,05 mg/ml)]; se evaluează viabilitatea celulară cu iodură de propidiu și se ajustează densitatea celulară la 1×10⁶ până la 2×10⁶ celule/ml. Înainte de citometria în flux, suspensia a fost filtrată printr-o sită celulară de 50 μm.
Citometru de flux. Sortarea celulelor a fost efectuată la 4°C utilizând aparatul FACSAria III (BD Biosciences) și software-ul FACSDiva (BD Biosciences, versiunea 8.0.1). Suspensia celulară a fost sortată utilizând o duză de 100 μm sub o presiune de 20 psi la o rată de ~2800 evenimente/sec. Deoarece criteriile tradiționale de gating (dimensiunea celulei, discriminarea bimodală și caracteristicile de împrăștiere) nu pot asigura izolarea corectă a PN de alte tipuri de celule, strategia de gating este stabilită pe baza comparației directe a intensității YFP și autofluorescenței la șoarecii mitoYFP+ ​​și mitoYFP − de control. YFP este excitat prin iradierea probei cu o linie laser de 488 nm, iar semnalul este detectat utilizând un filtru trece-bandă de 530/30 nm. La șoarecii mitoYFP+, puterea relativă a genei reporter Rosa26-mitoYFP este, de asemenea, utilizată pentru a distinge fragmentele de corp neuronal și de axon. 7-AAD este excitat cu un laser galben de 561 nm și detectat cu un filtru trece-bandă de 675/20 nm pentru a exclude celulele moarte. Pentru a separa astrocitele în același timp, suspensia celulară a fost colorată cu ACSA-2-APC, apoi proba a fost iradiată cu o linie laser de 640 nm și s-a utilizat un filtru trece-bandă de 660/20 nm pentru a detecta semnalul.
Celulele colectate au fost peletizate prin centrifugare (1110 rpm, 5 minute, 4°C) și depozitate la -80°C până la utilizare. Șoarecii Mfn2cKO și puii lor sunt clasificați în aceeași zi pentru a minimiza variabilitatea procedurală. Prezentarea și analiza datelor FACS au fost efectuate utilizând software-ul FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, SUA).
Așa cum s-a menționat mai sus (59), PCR în timp real este utilizat pentru a izola ADN-ul din neuronii sortați pentru cuantificarea ulterioară a ADN-ului mt. Linearitatea și sensibilitatea pragului au fost testate inițial prin rularea qPCR pe un număr diferit de celule. Pe scurt, se colectează 300 PN într-un tampon de liză constând din 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 și proteinază K (200 ng/ml) și se incubează la 55°C timp de 120 de minute. Celulele au fost incubate în continuare la 95°C timp de 10 minute pentru a asigura inactivarea completă a proteinazei K. Folosind o sondă TaqMan (Thermo Fisher) specifică mt-Nd1, ADN-ul mt a fost măsurat prin PCR semicantitativă în sistemul 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, număr de catalog Mm04225274_s1), genele mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, număr de catalog AIVI3E8) și 18S (Thermo Fisher Scientific, număr de catalog Hs99999901_s1).
Prepararea probei de proteom. Prin încălzirea soluției la 95°C timp de 10 minute și sonicare, în tamponul de liză [6 M clorură de guanidină, 10 mM clorhidrat de tris(2-carboxietil)fosfină, 10 mM cloracetamidă și 100 mM tris-Lize pelete de neuroni congelați în HCl]. Pe Bioruptor (Diagenode) timp de 10 minute (30 secunde impuls / 30 secunde pauză). Proba a fost diluată 1:10 în 20 mM tris-HCl (pH 8,0), amestecată cu 300 ng de aur de tripsină (Promega) și incubată peste noapte la 37°C pentru a obține o digestie completă. În a doua zi, proba a fost centrifugată la 20.000 g timp de 20 de minute. Supernatantul a fost diluat cu 0,1% acid formic, iar soluția a fost desalinizată cu vârfuri StageTips fabricate manual. Proba a fost uscată într-un instrument SpeedVac (concentrator Eppendorf plus 5305) la 45°C, iar apoi peptida a fost suspendată în acid formic 0,1%. Toate probele au fost preparate simultan de aceeași persoană. Pentru a analiza probele de astrocite, 4 μg de peptide desalinate au fost marcate cu o etichetă de masă în tandem (TMT10plex, număr de catalog 90110, Thermo Fisher Scientific) cu un raport peptidă:reactiv TMT de 1:20. Pentru marcarea TMT, 0,8 mg de reactiv TMT au fost resuspendate în 70 μl de ACN anhidru, iar peptida uscată a fost reconstituită în 9 μl de TEAB 0,1 M (bicarbonat de trietilamoniu), la care s-au adăugat 7 μl de reactiv TMT în ACN. Concentrația a fost de 43,75%. După 60 de minute de incubare, reacția a fost stinsă cu 2 μl de hidroxilamină 5%. Peptidele marcate au fost colectate, uscate, resuspendate în 200 μl de acid formic (FA) 0,1%, împărțite în două și apoi desalinate folosind vârfuri StageTip fabricate manual. Folosind un cromatograf de lichide de ultra-înaltă performanță UltiMate 3000 (cromatograf de lichide de ultra-înaltă performanță UltiMate 3000), una dintre cele două jumătăți a fost fracționată pe o coloană cromatografică Acquity de 1 mm x 150 mm umplută cu particule C18 de 130 Å1,7 μm (Waters, nr. catalog SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Se separă peptidele la un debit de 30 μl/min, se separă de la tampon B 1% la 50% timp de 85 de minute cu un gradient treptat de 96 de minute, de la tampon B 50% la 95% timp de 3 minute, apoi 8 minute pentru tampon B 95%. Tamponul A este 5% ACN și 10 mM bicarbonat de amoniu (ABC), iar tamponul B este 80% ACN și 10 mM ABC. Colectați fracțiile la fiecare 3 minute și combinați-le în două grupuri (1 + 17, 2 + 18 etc.) și uscați-le într-o centrifugă în vid.
Analiza LC-MS/MS. Pentru spectrometria de masă, peptidele (numărul r119.aq) au fost separate pe o coloană analitică PicoFrit de 25 cm și diametrul interior de 75 μm (lentilă obiectiv nouă, număr de piesă PF7508250) echipată cu mediu ReproSil-Pur 120 C18-AQ de 1,9 μm (Dr. Maisch, mat). Se utilizează EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germania). Coloana a fost menținută la 50°C. Tampoanele A și B sunt acid formic 0,1% în apă și, respectiv, acid formic 0,1% în ACN 80%. Peptidele au fost separate din tampon B 6% până la 31% timp de 65 de minute și din tampon B 31% până la 50% timp de 5 minute cu un gradient de 200 nl/min. Peptidele eluate au fost analizate pe un spectrometru de masă Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Măsurarea raportului m/z al precursorului peptidic este efectuată cu o rezoluție de 120.000 în intervalul 350 - 1500 m/z. Folosind o energie de coliziune normalizată de 27%, cel mai puternic precursor cu o stare de sarcină de la 2 la 6 este selectat pentru scindarea prin disociere a capcanei C (HCD) de înaltă energie. Timpul ciclului este setat la 1 s. Valoarea m/z a fragmentului de peptidă a fost măsurată în capcana de ioni folosind cea mai mică țintă AGC de 5×10⁴ și timpul maxim de injecție de 86 ms. După fragmentare, precursorul a fost plasat pe lista de excludere dinamică timp de 45 de secunde. Peptidele marcate cu TMT au fost separate pe o coloană Acclaim PepMap de 50 cm și 75 μm (Thermo Fisher Scientific, număr de catalog 164942), iar spectrele de migrare au fost analizate pe un spectrometru de masă Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) echipat cu echipament FAIMS (Thermo Fisher Scientific) care funcționează la două tensiuni de compensare de -50 și -70 V. MS3 selectat pe baza precursorului de sincronizare este utilizat pentru măsurarea semnalului ionic raportat TMT. Separarea peptidelor a fost efectuată pe EASY-nLC 1200, utilizând o eluție liniară cu gradient de 90%, cu o concentrație de tampon de 6% până la 31%; tamponul A a fost 0,1% FA, iar tamponul B a fost 0,1% FA și 80% ACN. Coloana analitică funcționează la 50°C. Utilizați FreeStyle (versiunea 1.6, Thermo Fisher Scientific) pentru a diviza fișierul original în funcție de tensiunea de compensare FAIMS.
Identificarea și cuantificarea proteinelor. Folosind motorul de căutare integrat Andromeda, datele originale au fost analizate folosind MaxQuant versiunea 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Pe lângă secvențele de recombinază Cre și YFP obținute de la Aequorea victoria, s-au căutat spectre de fragmente peptidice pentru secvența canonică și secvența izoformelor proteomului de referință de șoarece (ID-ul proteomului UP000000589, descărcat de pe UniProt în mai 2017). Oxidarea metioninei și acetilarea N-terminală a proteinei au fost setate ca modificări variabile; metilarea cisteinei carbamoil a fost setată ca modificări fixe. Parametrii de digestie sunt setați la „specificitate” și „tripsină/P”. Numărul minim de peptide și peptide razor utilizate pentru identificarea proteinelor este 1; numărul minim de peptide unice este 0. În condițiile de potrivire a hărții peptidice, rata de identificare a proteinelor a fost de 0,01. Opțiunea „A doua peptidă” este activată. Folosiți opțiunea „potrivire între rulări” pentru a transfera identificările reușite între diferite fișiere originale. Folosiți raportul minim LFQ de 1 pentru cuantificarea fără etichetă (LFQ) (60). Intensitatea LFQ este filtrată pentru cel puțin două valori valide în cel puțin un grup de genotipuri la fiecare moment și este extrapolată dintr-o distribuție normală cu o lățime de 0,0,3 și o coborâre de 1,8. Folosiți platforma de calcul Perseus (https://maxquant.net/perseus/) și R (https://r-project.org/) pentru a analiza rezultatele LFQ. Un test t moderat bidirecțional din pachetul software limma a fost utilizat pentru analiza expresiei diferențiale (61). Analiza exploratorie a datelor este efectuată folosind ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally și pheatmap. Datele proteomice bazate pe TMT au fost analizate folosind MaxQuant versiunea 1.6.10.43. Căutați date proteomice brute din baza de date de proteomică umană a UniProt, care a fost descărcată în septembrie 2018. Analiza include factorul de corecție a purității izotopilor furnizat de producător. Folosiți limma în R pentru analiza expresiei diferențiale. Datele originale, rezultatele căutării în baza de date, fluxul de lucru și rezultatele analizei datelor sunt toate stocate în alianța ProteomeXchange prin intermediul depozitului partener PRIDE cu identificatorul setului de date PXD019690.
Adnotările funcționale îmbogățesc analiza. Instrumentul Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) a fost utilizat pentru a determina bogăția termenilor de adnotare funcțională ai setului de date la 8 săptămâni (Figura 1). Pe scurt, lista cantitativă de proteine ​​obținută prin analiza datelor LC-MS/MS (spectrometrie de masă în tandem) este utilizată cu următoarele criterii de filtrare: Mus musculus este selectat ca specie și fond, iar categoria arată valoarea P ajustată de Benjamini pentru o îmbogățire de 0,05 sau mai mică, considerată semnificativă. Pentru acest grafic, sunt prezentate primele cinci categorii de exces din fiecare cluster pe baza valorii P ajustate. Folosind teste t multiple, folosind programul de amplificare liniară în două etape al lui Benjamini, Krieger și Yekutieli (Q = 5%), analiza expresiei proteinelor în timp este efectuată asupra candidaților importanți identificați în fiecare categorie, iar fiecare rând este analizat separat. Nu este nevoie să se adopte o deviație standard consistentă.
Pentru a compara rezultatele acestui studiu cu bazele de date publicate și a genera o diagramă Venn în Figura 1, am combinat lista cantitativă de proteine ​​cu adnotările MitoCarta 2.0 (24). Folosiți instrumentul online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) pentru a genera diagrama.
Pentru informații detaliate despre procedurile statistice utilizate pentru analiza proteomică, vă rugăm să consultați secțiunea corespunzătoare din Materiale și metode. Pentru toate celelalte experimente, informații detaliate pot fi găsite în legenda corespunzătoare. Cu excepția cazului în care se specifică altfel, toate datele sunt exprimate ca medie ± SEM, iar toate analizele statistice au fost efectuate utilizând software-ul GraphPad Prism 8.1.2.
Pentru materiale suplimentare pentru acest articol, vă rugăm să consultați http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Acesta este un articol cu ​​acces liber, distribuit în conformitate cu termenii Licenței Creative Commons Attribution-Non-Commercial, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea în orice mediu, atâta timp cât utilizarea finală nu este în scop comercial și premisa este că lucrarea originală este corectă. Referință.
Notă: Vă rugăm doar să ne furnizați adresa dvs. de e-mail, astfel încât persoana pe care o recomandați paginii să știe că doriți ca aceasta să vadă e-mailul și că nu este spam. Nu vom colecta nicio adresă de e-mail.
Această întrebare este folosită pentru a testa dacă sunteți vizitator și pentru a preveni trimiterea automată de spam.
De E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analiza proteomică a neuronilor disfuncționali a relevat că programele metabolice sunt activate pentru a contracara neurodegenerarea.
De E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analiza proteomică a neuronilor disfuncționali a relevat că programele metabolice sunt activate pentru a contracara neurodegenerarea.
©2020 Asociația Americană pentru Progresul Științei. Toate drepturile rezervate. AAAS este partener al HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef și COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.