Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru cele mai bune rezultate, vă recomandăm să utilizați o versiune mai nouă a browserului dvs. (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, afișăm site-ul fără stilizare sau JavaScript.
Acidul propionic (PPA) este utilizat pentru a studia rolul disfuncției mitocondriale în tulburările de neurodezvoltare, cum ar fi tulburarea din spectrul autist. Se știe că PPA perturbă biogeneza, metabolismul și rata de reînnoire a mitocondriilor. Cu toate acestea, efectele PPA asupra dinamicii mitocondriale, fisiunii și fuziunii rămân problematice din cauza naturii temporale complexe a acestor mecanisme. Aici, folosim tehnici complementare de imagistică cantitativă pentru a investiga modul în care PPA afectează ultrastructura, morfologia și dinamica mitocondrială în celulele SH-SY5Y de tip neuron. PPA (5 mM) a cauzat o scădere semnificativă a ariei mitocondriale (p < 0,01), a diametrului și circumferinței Feret (p < 0,05) și a ariei 2 (p < 0,01). Analiza localizatorului de evenimente mitocondriale a arătat o creștere semnificativă (p < 0,05) a evenimentelor de fisiune și fuziune, menținând astfel integritatea rețelei mitocondriale în condiții de stres. În plus, expresia ARNm a cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) și OPA1 (p < 0,05) a fost semnificativ redusă. 01). Aceasta ilustrează remodelarea morfologiei, biogenezei și dinamicii mitocondriale pentru a menține funcția în condiții de stres. Datele noastre oferă noi perspective asupra efectelor PPA asupra dinamicii mitocondriale și evidențiază utilitatea tehnicilor imagistice pentru studierea mecanismelor complexe de reglare implicate în răspunsurile la stres mitocondrial.
Mitocondriile sunt participanți integranți la o varietate de funcții celulare, dincolo de rolurile lor tipice în producerea de energie și biosinteză. Metabolismul mitocondrial este un regulator cheie al semnalizării calciului, homeostaziei metabolice și redox, semnalizării inflamatorii, modificărilor epigenetice, proliferării celulare, diferențierii și morții celulare programate1. În special, metabolismul mitocondrial este esențial pentru dezvoltarea, supraviețuirea și funcția neuronală și este implicat pe scară largă în diverse manifestări ale neuropatologiei2,3,4.
În ultimul deceniu, statusul metabolic a apărut ca un regulator central al neurogenezei, diferențierii, maturării și plasticității5,6. Recent, morfologia și dinamica mitocondrială au devenit componente deosebit de importante ale mitozei, un proces dinamic care menține un grup de mitocondrii sănătoase în interiorul celulelor. Dinamica mitocondrială este reglată de căi complexe interdependente, de la biogeneza și bioenergetica mitocondrială până la fisiunea, fuziunea, transportul și clearance-ul mitocondrial7,8. Întreruperea oricăruia dintre aceste mecanisme integrative afectează menținerea rețelelor mitocondriale sănătoase și are consecințe funcționale profunde asupra neurodezvoltării9,10. Într-adevăr, disreglarea dinamicii mitocondriale este observată în multe tulburări psihiatrice, neurodegenerative și de neurodezvoltare, inclusiv tulburări din spectrul autist (TSA)11,12.
TSA este o tulburare neurodezvoltării eterogenă cu o arhitectură genetică și epigenetică complexă. Eritabilitatea TSA este incontestabilă, dar etiologia moleculară subiacentă rămâne puțin înțeleasă. Datele acumulate din modele preclinice, studii clinice și seturi de date moleculare multi-omice oferă dovezi tot mai mari ale disfuncției mitocondriale în TSA13,14. Anterior, am efectuat un screening al metilării ADN-ului la nivelul întregului genom într-o cohortă de pacienți cu TSA și am identificat gene metilate diferențial, grupate de-a lungul căilor metabolice mitocondriale15. Ulterior, am raportat metilarea diferențială a regulatorilor centrali ai biogenezei și dinamicii mitocondriale, care a fost asociată cu creșterea numărului de copii ale ADNmt și cu un profil metabolic urinar modificat în TSA16. Datele noastre oferă dovezi tot mai mari că dinamica mitocondrială și homeostazia joacă un rol central în fiziopatologia TSA. Prin urmare, îmbunătățirea înțelegerii mecanistice a relației dintre dinamica, morfologia și funcția mitocondrială este un obiectiv cheie al cercetării în curs privind bolile neurologice caracterizate prin disfuncție mitocondrială secundară.
Tehnicile moleculare sunt adesea utilizate pentru a studia rolul unor gene specifice în răspunsurile la stresul mitocondrial. Cu toate acestea, această abordare poate fi limitată de natura multifațetată și temporală a mecanismelor de control mitotic. Mai mult, exprimarea diferențială a genelor mitocondriale este un indicator indirect al modificărilor funcționale, mai ales că doar un număr limitat de gene sunt de obicei analizate. Prin urmare, au fost propuse metode mai directe pentru studierea funcției mitocondriale și a bioenergeticii17. Morfologia mitocondrială este strâns legată de dinamica mitocondrială. Forma, conectivitatea și structura mitocondriale sunt esențiale pentru producerea de energie și supraviețuirea mitocondrială și celulară5,18. Mai mult, diversele componente ale mitozei se concentrează pe modificările morfologiei mitocondriale, care pot servi ca puncte finale utile ale disfuncției mitocondriale și pot oferi o bază pentru studii mecanistice ulterioare.
Morfologia mitocondrială poate fi observată direct folosind microscopia electronică de transmisie (TEM), permițând studiul detaliat al ultrastructurii celulare. TEM vizualizează direct morfologia, forma și structura cristelor mitocondriale la rezoluția mitocondriilor individuale, în loc să se bazeze exclusiv pe transcripția genelor, expresia proteinelor sau parametrii funcționali mitocondriali în populațiile celulare17,19,20. În plus, TEM facilitează studiul interacțiunilor dintre mitocondrii și alte organite, cum ar fi reticulul endoplasmatic și autofagozomii, care joacă roluri cheie în funcția mitocondrială și homeostazie21,22. Astfel, acest lucru face din TEM un bun punct de plecare pentru studierea disfuncției mitocondriale înainte de a se concentra pe căi sau gene specifice. Pe măsură ce funcția mitocondrială devine din ce în ce mai relevantă pentru neuropatologie, există o nevoie clară de a putea studia direct și cantitativ morfologia și dinamica mitocondrială în modele neuronale in vitro.
În acest articol, examinăm dinamica mitocondrială într-un model neuronal al disfuncției mitocondriale în tulburarea de spectru autist. Anterior, am raportat metilarea diferențială a propionil-CoA carboxilazei beta (PCCB) în ASD15, o subunitate a enzimei propionil-CoA carboxilazei mitocondriale PCC. Se știe că disreglarea PCC provoacă acumularea toxică de derivați de propionil, inclusiv acidul propionic (PPA)23,24,25. S-a demonstrat că PPA perturbă metabolismul neuronal și modifică comportamentul in vivo și este un model animal consacrat pentru studierea mecanismelor neurodezvoltării implicate în ASD26,27,28. În plus, s-a raportat că PPA perturbă potențialul membranei mitocondriale, biogeneza și respirația in vitro și a fost utilizat pe scară largă pentru a modela disfuncția mitocondrială la neuroni29,30. Cu toate acestea, impactul disfuncției mitocondriale induse de PPA asupra morfologiei și dinamicii mitocondriale rămâne puțin înțeles.
Acest studiu utilizează tehnici imagistice complementare pentru a cuantifica efectele PPA asupra morfologiei, dinamicii și funcției mitocondriale în celulele SH-SY5Y. În primul rând, am dezvoltat o metodă TEM pentru a vizualiza modificările morfologiei și ultrastructurii mitocondriale17,31,32. Având în vedere natura dinamică a mitocondriilor33, am utilizat și analiza localizatorului de evenimente mitocondriale (MEL) pentru a cuantifica modificările echilibrului dintre evenimentele de fisiune și fuziune, numărul și volumul mitocondriilor sub stresul PPA. În cele din urmă, am examinat dacă morfologia și dinamica mitocondrială sunt asociate cu modificări ale expresiei genelor implicate în biogeneză, fisiune și fuziune. Luate împreună, datele noastre ilustrează provocarea de a elucida complexitatea mecanismelor care reglează dinamica mitocondrială. Evidențiem utilitatea TEM în studierea morfologiei mitocondriale ca punct final convergent măsurabil al mitozei în celulele SH-SY5Y. În plus, subliniem faptul că datele TEM oferă cele mai bogate informații atunci când sunt combinate cu tehnici imagistice care surprind și evenimente dinamice ca răspuns la stresul metabolic. Caracterizarea suplimentară a mecanismelor de reglare moleculară care susțin mitoza celulelor neuronale ar putea oferi informații importante despre componenta mitocondrială a sistemului nervos și a bolilor neurodegenerative.
Pentru a induce stresul mitocondrial, celulele SH-SY5Y au fost tratate cu PPA folosind 3 mM și 5 mM propionat de sodiu (NaP). Înainte de TEM, probele au fost supuse preparării criogenice a probelor folosind congelare la presiune înaltă și congelare (Fig. 1a). Am dezvoltat o conductă automată de analiză a imaginilor mitocondriale pentru a măsura opt parametri morfologici ai populațiilor mitocondriale în trei replici biologice. Am constatat că tratamentul cu PPA a modificat semnificativ patru parametri: aria 2, aria, perimetrul și diametrul Feret (Fig. 1b-e). Aria 2 a scăzut semnificativ atât cu tratamentul cu PPA de 3 mM, cât și cu cel cu 5 mM (p = 0,0183 și respectiv p = 0,002) (Fig. 1b), în timp ce aria (p = 0,003), perimetrul (p = 0,0106) și diametrul Feret au scăzut semnificativ. A existat o reducere semnificativă (p = 0,0172) în grupul de tratament cu 5 mM comparativ cu grupul de control (Fig. 1c-e). Reduceri semnificative ale suprafeței și circumferinței au arătat că celulele tratate cu 5 mM PPA aveau mitocondrii mai mici și mai rotunjite și că aceste mitocondrii erau mai puțin alungite decât cele din celulele de control. Acest lucru este, de asemenea, în concordanță cu o scădere semnificativă a diametrului Feret, un parametru independent care indică o scădere a celei mai mari distanțe dintre marginile particulelor. Au fost observate modificări ale ultrastructurii cristelor: cristele au devenit mai puțin pronunțate sub influența stresului PPA (Fig. 1a, panoul B). Cu toate acestea, nu toate imaginile au reflectat clar ultrastructura cristelor, astfel încât nu a fost efectuată o analiză cantitativă a acestor modificări. Aceste date TEM pot reflecta trei scenarii posibile: (1) PPA amplifică fisiunea sau inhibă fuziunea, determinând micșorarea mitocondriilor existente; (2) biogeneza îmbunătățită creează mitocondrii noi, mai mici sau (3) induce ambele mecanisme simultan. Deși aceste condiții nu pot fi distinse prin TEM, modificări morfologice semnificative indică modificări ale homeostaziei și dinamicii mitocondriale sub stresul PPA. Ulterior, am explorat parametri suplimentari pentru a caracteriza în continuare această dinamică și mecanismele potențiale care stau la baza acesteia.
Acidul propionic (PPA) remodelează morfologia mitocondrială. (a) Imagini reprezentative de microscopie electronică de transmisie (TEM) care arată că dimensiunea mitocondriilor scade, iar mitocondriile devin mai mici și mai rotunjite odată cu creșterea tratamentului cu PPA; 0 mM (netratat), 3 mM și respectiv 5 mM. Săgețile roșii indică mitocondriile. (b-e) Celulele SH-SY5Y tratate cu PPA timp de 24 de ore au fost preparate pentru TEM, iar rezultatele au fost analizate folosind Fiji/ImageJ. Patru dintre cei opt parametri au arătat diferențe semnificative între celulele de control (netratate, 0 mM PPA) și cele tratate (3 mM și 5 mM PPA). (b) Regiunea 2, (c) Suprafață, (d) Perimetru, (e) Diametrul Feret. Analiza unidirecțională a varianței (control vs. tratament) și testul de comparație multiplă Dunnett au fost utilizate pentru a determina diferențe semnificative (p < 0,05). Punctele de date reprezintă valoarea mitocondrială medie pentru fiecare celulă individuală, iar barele de eroare reprezintă media ± SEM. Datele prezentate reprezintă n = 3, cel puțin 24 de celule per replicat; au fost analizate un total de 266 de imagini; * indică p < 0,05, ** indică p < 0,01.
Pentru a caracteriza în continuare modul în care dinamica mitocondrială răspunde la PPA, am colorat mitocondriile cu ester etilic de tetrametilrodamină (TMRE) și am utilizat microscopia time-lapse și analiza MEL pentru a localiza și cuantifica mitocondriile după 24 de ore la 3 și 5 mM PPA. Tratamentul evenimentelor de fisiune și fuziune. (Fig. 2a). După analiza MEL, mitocondriile au fost analizate în continuare pentru a cuantifica numărul de structuri mitocondriale și volumul lor mediu. Am observat o creștere mică, dar semnificativă, a numărului de evenimente de fisiune care au avut loc la 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] comparativ cu fisiunea [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] și fuziunea [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] și fuziunea [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] <0,05)] au fost semnificativ crescute la 5 mM comparativ cu controlul (Fig. 3b). Numărul de mitocondrii a crescut semnificativ atât la 3 mM [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], cât și la 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), în timp ce volumul mediu al fiecărei structuri mitocondriale a rămas neschimbat (Fig. 3c). 3d). Luate împreună, acestea sugerează că remodelarea dinamicii mitocondriale servește ca un răspuns compensatoriu care menține cu succes integritatea rețelei mitocondriale. Creșterea numărului de evenimente de fisiune la 3 mM PPA sugerează că creșterea numărului de mitocondrii se datorează parțial fisiunii mitocondriale, dar având în vedere că volumul mitocondrial mediu rămâne în esență neschimbat, biogeneza nu poate fi exclusă ca un răspuns compensatoriu suplimentar. Cu toate acestea, aceste date sunt în concordanță cu structurile mitocondriale mai mici, rotunde, observate prin TEM și demonstrează, de asemenea, modificări semnificative în dinamica mitocondrială indusă de PPA.
Acidul propionic (PPA) induce remodelarea dinamică mitocondrială pentru a menține integritatea rețelei. Celulele SH-SY5Y au fost cultivate, tratate cu 3 și 5 mM PPA timp de 24 de ore și colorate cu TMRE și Hoechst 33342, urmate de analiza MEL. (a) Imagini reprezentative de microscopie time-lapse care prezintă proiecții color și binarizate ale intensității maxime la momentul 2 (t2) pentru fiecare condiție. Regiunile selectate indicate în fiecare imagine binară sunt îmbunătățite și afișate în 3D la trei intervale de timp diferite (t1-t3) pentru a ilustra dinamica în timp; evenimentele de fuziune sunt evidențiate cu verde; evenimentele de fisiune sunt evidențiate cu verde. Afișate cu roșu. (b) Număr mediu de evenimente dinamice per condiție. (c) Număr mediu de structuri mitocondriale per celulă. (d) Volumul mediu (µm3) al fiecărei structuri mitocondriale per celulă. Datele prezentate sunt reprezentative pentru n = 15 celule per grup de tratament. Barele de eroare prezentate reprezintă media ± SEM, bara de scală = 10 μm, * p < 0,05.
Acidul propionic (PPA) provoacă supresia transcripțională a genelor asociate cu dinamica mitocondrială. Celulele SH-SY5Y au fost tratate cu 3 și 5 mM PPA timp de 24 de ore. Cuantificarea relativă a genelor a fost efectuată folosind RT-qPCR și normalizată la B2M. Genele biogenezei mitocondriale (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 și (d) NFE2L2. Genele fuziunii și fisiunii mitocondriale (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 și (i) DRP1. Diferențele semnificative (p < 0,05) au fost testate folosind ANOVA cu o singură direcție (control vs. tratament) și testul de comparație multiplă Dunnett: * indică p < 0,05, ** indică p < 0,01, iar **** indică p < 0,0001. Barele reprezintă expresia medie ± SEM. Datele prezentate reprezintă n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) și n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) replici biologice.
Datele obținute împreună prin analize TEM și MEL indică faptul că PPA modifică morfologia și dinamica mitocondrială. Cu toate acestea, aceste tehnici de imagistică nu oferă informații despre mecanismele care stau la baza acestor procese. Prin urmare, am examinat expresia ARNm a nouă regulatori cheie ai dinamicii mitocondriale, biogenezei și mitozei ca răspuns la tratamentul cu PPA. Am cuantificat oncogena mielomului celular (cMYC), factorul respirator nuclear (NRF1), factorul de transcripție mitocondrial 1 (TFAM), factorul de transcripție de tip NFE2 BZIP (NFE2L2), proteina de tip gastrină 2 (STOML2), atrofia nervului optic 1 (OPA1), Mitofusina 1 (MFN1), Mitofusina 2 (MFN2) și proteina 1 legată de dinamină (DRP1) după 24 de ore de tratament cu 3 mM și 5 mM PPA. Am observat un tratament cu PPA de 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 și p < 0,0001, respectiv) și 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Fig. 3a-c). Scăderea expresiei ARNm a fost dependentă de doză: expresia cMYC, NRF1 și TFAM a scăzut de 5,7, 2,6 și 1,9 ori la 3 mM, respectiv, și de 11,2, 3 și 2,2 ori la 5 mM. În schimb, gena centrală de biogeneze redox NFE2L2 nu a fost modificată la nicio concentrație de PPA, deși s-a observat o tendință similară dependentă de doză de scădere a expresiei (Fig. 3d).
De asemenea, am examinat expresia genelor clasice implicate în reglarea fisiunii și fuziunii. Se consideră că STOML2 este implicată în fuziune, mitofagie și biogeneză, iar expresia sa a fost semnificativ redusă (p < 0,0001) cu 3 mM (modificare de 2,4 ori) și 5 mM (modificare de 2,8 ori) PPA (Fig. 1). 3d). În mod similar, expresia genei de fuziune OPA1 a fost scăzută la 3 mM (modificare de 1,6 ori) și 5 mM (modificare de 1,9 ori) PPA (p = 0,006 și respectiv p = 0,0024) (Fig. 3f). Cu toate acestea, nu am găsit diferențe semnificative în expresia genelor de fuziune MFN1, MFN2 sau a genei de fisiune DRP1 sub stres PPA de 24 de ore (Fig. 3g-i). În plus, am constatat că nivelurile a patru proteine ​​de fuziune și fisiune (OPA1, MFN1, MFN2 și DRP1) nu s-au modificat în aceleași condiții (Fig. 4a-d). Este important de menționat că aceste date reflectă un singur moment în timp și este posibil să nu reflecte modificările expresiei proteinelor sau ale nivelurilor de activitate în timpul stadiilor incipiente ale stresului PPA. Cu toate acestea, reducerile semnificative ale expresiei cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 și OPA1 indică o disreglare transcripțională semnificativă a metabolismului, biogenezei și dinamicii mitocondriale. În plus, aceste date evidențiază utilitatea tehnicilor imagistice pentru a studia direct modificările stării finale în funcția mitocondrială.
Nivelurile proteinelor factorului de fuziune și fisiune nu s-au modificat după tratamentul cu acid propionic (PPA). Celulele SH-SY5Y au fost tratate cu 3 și 5 mM PPA timp de 24 de ore. Nivelurile de proteine ​​au fost cuantificate prin analiza Western blot, iar nivelurile de expresie au fost normalizate la proteina totală. Sunt prezentate expresia medie a proteinelor și Western bloturile reprezentative ale proteinei țintă și totale. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Barele reprezintă media ± SEM, iar datele prezentate sunt reprezentative pentru n = 3 replici biologice. Comparațiile multiple (p < 0,05) au fost efectuate utilizând analiza varianței într-o singură direcție și testul Dunnett. Gelul și blot-ul originale sunt prezentate în Figura S1.
Disfuncția mitocondrială este asociată cu boli multisistemice, de la boli metabolice, cardiovasculare și musculare până la boli neurologice1,10. Multe boli neurodegenerative și neurodegenerative sunt asociate cu disfuncție mitocondrială, subliniind importanța acestor organite pe tot parcursul vieții creierului. Aceste boli includ boala Parkinson, boala Alzheimer și tulburarea de spectru autist3,4,18. Cu toate acestea, accesul la țesutul cerebral pentru a studia aceste boli este dificil, în special la nivel mecanistic, ceea ce face ca sistemele model celular să fie o alternativă necesară. În acest studiu, folosim un sistem model celular care utilizează celule SH-SY5Y tratate cu PPA pentru a recapitula disfuncția mitocondrială observată în bolile neuronale, în special în tulburările din spectrul autist. Utilizarea acestui model PPA pentru a studia dinamica mitocondrială la neuroni poate oferi informații despre etiologia tulburării de spectru autist.
Am explorat posibilitatea utilizării TEM pentru a vizualiza modificările morfologiei mitocondriale. Este important de menționat că TEM trebuie utilizat corect pentru a-i maximiza eficacitatea. Prepararea specimenelor criogenice permite o mai bună conservare a structurilor neuronale prin fixarea simultană a componentelor celulare și reducerea formării de artefacte34. În concordanță cu aceasta, am observat că celulele SH-SY5Y de tip neuron aveau organite subcelulare intacte și mitocondrii alungite (Fig. 1a). Acest lucru evidențiază utilitatea tehnicilor de preparare criogenică pentru studierea morfologiei mitocondriale în modelele de celule neuronale. Deși măsurătorile cantitative sunt esențiale pentru analiza obiectivă a datelor TEM, încă nu există un consens cu privire la parametrii specifici care ar trebui măsurați pentru a confirma modificările morfologice mitocondriale. Pe baza unui număr mare de studii care au examinat cantitativ morfologia mitocondrială17,31,32, am dezvoltat o conductă automată de analiză a imaginilor mitocondriale care măsoară opt parametri morfologici, și anume: aria, aria2, raportul de aspect, perimetrul, circularitatea, gradul, diametrul Feret și rotunjimea.
Printre acestea, PPA a redus semnificativ aria 2, aria, perimetrul și diametrul Feret (Fig. 1b-e). Acest lucru a arătat că mitocondriile au devenit mai mici și mai rotunjite, ceea ce este în concordanță cu studiile anterioare care au arătat o scădere a ariei mitocondriale după 72 de ore de stres mitocondrial indus de PPA30. Aceste caracteristici morfologice pot indica fisiunea mitocondrială, un proces necesar pentru a sechestra componentele deteriorate din rețeaua mitocondrială pentru a promova degradarea lor prin mitofagie35,36,37. Pe de altă parte, scăderea dimensiunii mitocondriale medii poate fi asociată cu o biogenezei crescute, ceea ce duce la formarea de mitocondrii mici și nascente. Creșterea fisiunii sau biogenezei reprezintă un răspuns compensatoriu pentru a menține mitoza împotriva stresului mitocondrial. Cu toate acestea, nu pot fi excluse creșterea mitocondrială scăzută, fuziunea afectată sau alte afecțiuni.
Deși imaginile de înaltă rezoluție create prin TEM permit determinarea caracteristicilor morfologice la nivelul mitocondriilor individuale, această metodă produce instantanee bidimensionale la un singur moment în timp. Pentru a studia răspunsurile dinamice la stresul metabolic, am colorat mitocondriile cu TMRE și am utilizat microscopia time-lapse cu analiza MEL, care permite vizualizarea 3D de mare randament a modificărilor rețelei mitocondriale în timp33,38. Am observat modificări subtile, dar semnificative, în dinamica mitocondrială sub stresul PPA (Fig. 2). La 3 mM, numărul de evenimente de fisiune a crescut semnificativ, în timp ce evenimentele de fuziune au rămas aceleași ca în control. O creștere a numărului de evenimente atât de fisiune, cât și de fuziune a fost observată la 5 mM PPA, dar aceste modificări au fost aproximativ proporționale, sugerând că cinetica fisiunii și a fuziunii atinge echilibrul la concentrații mai mari (Fig. 2b). Volumul mitocondrial mediu a rămas neschimbat atât la 3, cât și la 5 mM PPA, indicând faptul că integritatea rețelei mitocondriale a fost prezervată (Fig. 2d). Aceasta reflectă capacitatea rețelelor mitocondriale dinamice de a răspunde la stres metabolic ușor pentru a menține eficient homeostazia fără a provoca fragmentarea rețelei. La 3 mM PPA, creșterea fisiunii este suficientă pentru a promova tranziția către un nou echilibru, dar este necesară o remodelare cinetică mai profundă ca răspuns la stresul indus de concentrații mai mari de PPA.
Numărul de mitocondrii a crescut la ambele concentrații de stres PPA, dar volumul mitocondrial mediu nu s-a modificat semnificativ (Fig. 2c). Acest lucru se poate datora biogenezei crescute sau diviziunii crescute; cu toate acestea, în absența unei scăderi semnificative a volumului mitocondrial mediu, este mai probabil ca biosinteza să crească. Cu toate acestea, datele din Figura 2 susțin existența a două mecanisme compensatorii: o creștere a numărului de evenimente de fisiune, în concordanță cu suprareglarea fisiunii mitocondriale, și o creștere a numărului de evenimente, în concordanță cu biogeneza mitocondrială. În cele din urmă, compensarea dinamică pentru stresul ușor poate consta în procese simultane care implică fisiune, fuziune, biogeneză și mitofagie. Deși autorii anteriori au arătat că PPA amplifică mitoza30,39 și mitofagia29, noi oferim dovezi pentru remodelarea dinamicii fisiunii și fuziunii mitocondriale ca răspuns la PPA. Aceste date confirmă modificările morfologice observate prin TEM și oferă o perspectivă mai profundă asupra mecanismelor asociate cu disfuncția mitocondrială indusă de PPA.
Deoarece nici analiza TEM, nici cea MEL nu au furnizat dovezi directe ale mecanismelor de reglare genetică care stau la baza modificărilor morfologice observate, am examinat expresia ARN a genelor implicate în metabolismul, biogeneza și dinamica mitocondriilor. Proto-oncogena cMYC este un factor de transcripție implicat în reglarea mitocondriilor, glicolizei, metabolismului aminoacizilor și acizilor grași40. În plus, se știe că cMYC reglează expresia a aproape 600 de gene mitocondriale implicate în transcripția, traducerea și asamblarea complexelor mitocondriale, inclusiv NRF1 și TFAM41. NRF1 și TFAM sunt doi regulatori centrali ai mitozei, acționând în aval de PGC-1α pentru a activa replicarea ADN-ului mitocondrial. Această cale este activată prin semnalizarea cAMP și AMPK și este sensibilă la cheltuielile energetice și la stresul metabolic. De asemenea, am examinat NFE2L2, un regulator redox al biogenezei mitocondriale, pentru a determina dacă efectele PPA ar putea fi mediate de stresul oxidativ.
Deși expresia NFE2L2 a rămas neschimbată, am observat o scădere constantă, dependentă de doză, a expresiei cMYC, NRF1 și TFAM după 24 de ore de tratament cu 3 mM și 5 mM PPA (Fig. 3a-c). Indicele expresiei cMYC a fost raportat anterior ca răspuns la stresul mitocondrial42 și, invers, incidența expresiei cMYC poate cauza disfuncție mitocondrială prin remodelarea metabolismului mitocondrial, a conectivității rețelei și a polarizării membranei43. Interesant este că cMYC este implicat și în reglarea fisiunii și fuziunii mitocondriale42,43 și se știe că crește fosforilarea DRP1 și localizarea mitocondrială în timpul diviziunii celulare44, precum și că mediază remodelarea morfologică mitocondrială în celulele stem neuronale45. Într-adevăr, fibroblastele cu deficit de cMYC prezintă o dimensiune mitocondrială redusă, în concordanță cu modificările induse de stresul PPA43. Aceste date ilustrează o relație interesantă, dar încă neclară, între cMYC și dinamica mitocondrială, oferind o țintă interesantă pentru studii viitoare privind remodelarea indusă de stresul PPA.
Reducerea NRF1 și TFAM este în concordanță cu rolul cMYC ca activator transcripțional important. Aceste date sunt, de asemenea, în concordanță cu studiile anterioare efectuate pe celule de cancer de colon uman, care arată că PPA a redus expresia ARNm a NRF1 la 22 de ore, ceea ce a fost asociat cu epuizarea ATP și creșterea ROS46. Acești autori au raportat, de asemenea, că expresia TFAM a crescut la 8,5 ore, dar a revenit la nivelurile inițiale la 22 de ore. În schimb, Kim și colab. (2019) au arătat că expresia ARNm a TFAM a fost semnificativ scăzută după 4 ore de stres PPA în celulele SH-SY5Y; cu toate acestea, după 72 de ore, expresia proteinei TFAM a fost semnificativ crescută, iar numărul de copii ale ADNmt a crescut semnificativ. Astfel, scăderea numărului de gene de biogeneză mitocondrială pe care am observat-o după 24 de ore nu exclude posibilitatea ca creșterea numărului de mitocondrii să fie asociată cu activarea biogenezei la momente mai timpurii. Studiile anterioare au arătat că PPA crește semnificativ nivelul ARNm și al proteinei PGC-1α în celulele SH-SY5Y la 4 ore și 30 de minute, în timp ce acidul propionic sporește biogeneza mitocondrială în hepatocitele de vițel prin intermediul PGC-1α la 12 ore și 39 de minute. Interesant este că PGC-1α nu este doar un regulator transcripțional direct al NRF1 și TFAM, ci s-a demonstrat că reglează și activitatea MFN2 și DRP1 prin reglarea fisiunii și fuziunii47. Luate împreună, acestea evidențiază strânsa cuplare a mecanismelor care reglează răspunsurile compensatorii mitocondriale induse de PPA. Mai mult, datele noastre reflectă o disreglare semnificativă a reglării transcripționale a biogenezei și metabolismului sub stresul PPA.
Genele STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 și DRP1 se numără printre regulatorii centrali ai fisiunii, fuziunii și dinamicii mitocondriale37,48,49. Există multe alte gene implicate în dinamica mitocondrială, cu toate acestea, STOML2, OPA1 și MFN2 au fost descoperite anterior a fi metilate diferențiat în cohortele ASD,16 și mai multe studii independente au raportat modificări ale acestor factori de transcripție ca răspuns la stresul mitocondrial50,51.52. Expresia atât a OPA1, cât și a STOML2 a fost redusă semnificativ prin tratamentul cu PPA de 3 mM și 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 este unul dintre regulatorii clasici ai fuziunii mitocondriale prin interacțiunea directă cu MFN1 și 2 și joacă un rol în remodelarea cristelor și morfologia mitocondrială53. Rolul precis al STOML2 în dinamica mitocondrială rămâne neclar, dar dovezile sugerează că joacă un rol în fuziunea mitocondrială, biogeneză și mitofagie.
STOML2 este implicat în menținerea cuplării respiratorii mitocondriale și în formarea complexelor lanțului respirator54,55 și s-a demonstrat că modifică profund caracteristicile metabolice ale celulelor canceroase56. Studiile au arătat că STOML2 promovează potențialul membranei mitocondriale și biogeneza prin interacțiunea cu BAN și cardiolipina 55, 57, 58. În plus, studii independente au arătat că interacțiunea dintre STOML2 și PINK1 reglează mitofagia59,60. În special, s-a raportat că STOML2 interacționează direct cu MFN2 și îl stabilizează și joacă, de asemenea, un rol important în stabilizarea izoformelor lungi OPA1 prin inhibarea proteazei responsabile de degradarea OPA153,61,62. Reducerea expresiei STOML2 observată în reacțiile PPA poate face aceste proteine ​​de fuziune mai susceptibile la degradare prin căi dependente de ubiquitină și proteazom48. Deși rolul precis al STOML2 și OPA1 în răspunsul dinamic la PPA este neclar, scăderea expresiei acestor gene de fuziune (Figura 3) poate perturba echilibrul dintre fisiune și fuziune și poate duce la scăderea dimensiunii mitocondriilor (Figura 3). 1).
Pe de altă parte, expresia proteinei OPA1 a rămas neschimbată după 24 de ore, în timp ce nivelurile de ARNm și proteine ​​ale MFN1, MFN2 sau DRP1 nu s-au modificat semnificativ după tratamentul cu PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Acest lucru poate indica faptul că nu există modificări în reglarea acestor factori implicați în fuziunea și fisiunea mitocondrială. Cu toate acestea, este demn de remarcat faptul că fiecare dintre aceste patru gene este, de asemenea, reglată prin modificări post-transcripționale (PTM) care controlează activitatea proteinelor. OPA1 are opt variante alternative de splicing care sunt scindate proteolitic în mitocondrii pentru a produce două izoforme distincte63. Echilibrul dintre izoformele lungi și scurte determină în cele din urmă rolul OPA1 în fuziunea mitocondrială și menținerea rețelei mitocondriale64. Activitatea DRP1 este reglată prin fosforilarea protein kinazei II dependente de calciu/calmodulină (CaMKII), în timp ce degradarea DRP1 este reglată prin ubiquitinare și SUMOilare65. În cele din urmă, atât DRP1, cât și MFN1/2 sunt GTPaze, deci activitatea poate fi influențată de rata de producție a GTP în mitocondrii66. Prin urmare, deși expresia acestor proteine ​​rămâne constantă, acest lucru poate să nu reflecte activitatea sau localizarea proteinelor neschimbată67,68. Într-adevăr, repertoriile existente de proteine ​​PTM servesc adesea ca primă linie de apărare responsabilă de medierea răspunsurilor acute la stres. În prezența unui stres metabolic moderat în modelul nostru, este probabil ca PTM să promoveze o activitate crescută a proteinelor de fuziune și fisiune pentru a restabili suficient integritatea mitocondrială fără a necesita activarea suplimentară a acestor gene la nivel de ARNm sau proteină.
Luate împreună, datele de mai sus evidențiază reglarea complexă și dependentă de timp a morfologiei mitocondriale și provocările elucidării acestor mecanisme. Pentru a studia expresia genelor, este mai întâi necesar să se identifice gene țintă specifice din această cale. Cu toate acestea, datele noastre arată că genele din aceeași cale nu răspund în același mod la același stres. De fapt, studiile anterioare au arătat că diferite gene din aceeași cale pot prezenta profiluri de răspuns temporal diferite30,46. În plus, există mecanisme post-transcripționale complexe care perturbă relația dintre transcripție și funcția genelor. Studiile proteomice pot oferi informații despre impactul PTM-urilor și al funcției proteinelor, dar prezintă și provocări, inclusiv metode cu randament redus, raporturi semnal-zgomot ridicate și rezoluție slabă.
În acest context, studierea morfologiei mitocondriale folosind TEM și MEL are un mare potențial de a aborda întrebări fundamentale despre relația dintre dinamica și funcția mitocondrială și modul în care aceasta influențează boala. Cel mai important, TEM oferă o metodă directă pentru măsurarea morfologiei mitocondriale ca punct final convergent al disfuncției și dinamicii mitocondriale51. MEL oferă, de asemenea, o metodă directă pentru vizualizarea evenimentelor de fisiune și fuziune într-un mediu celular tridimensional, permițând cuantificarea remodelării mitocondriale dinamice chiar și în absența modificărilor în expresia genelor33. Aici evidențiem utilitatea tehnicilor de imagistică mitocondrială în bolile mitocondriale secundare. Aceste boli sunt de obicei caracterizate prin stres metabolic ușor cronic, caracterizat prin remodelarea subtilă a rețelelor mitocondriale, mai degrabă decât prin leziuni mitocondriale acute. Cu toate acestea, compensarea mitocondrială necesară pentru a menține mitoza sub stres cronic are consecințe funcționale profunde. În contextul neuroștiinței, o mai bună înțelegere a acestor mecanisme compensatorii poate oferi informații importante despre neuropatologia pleiotropică asociată cu disfuncția mitocondrială.
În cele din urmă, datele noastre evidențiază utilitatea tehnicilor imagistice pentru înțelegerea consecințelor funcționale ale interacțiunilor complexe dintre expresia genelor, modificările proteinelor și activitatea proteinelor care controlează dinamica mitocondrială neuronală. Am utilizat PPA pentru a modela disfuncția mitocondrială într-un model de celule neuronale pentru a obține o perspectivă asupra componentei mitocondriale a TSA. Celulele SH-SY5Y tratate cu PPA au prezentat modificări în morfologia mitocondrială: mitocondriile au devenit mici și rotunde, iar cristele au fost slab definite atunci când au fost observate prin TEM. Analiza MEL arată că aceste modificări apar concomitent cu o creștere a evenimentelor de fisiune și fuziune pentru a menține rețeaua mitocondrială ca răspuns la stresul metabolic ușor. Mai mult, PPA perturbă semnificativ reglarea transcripțională a metabolismului mitocondrial și a homeostaziei. Am identificat cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 și OPA1 ca regulatori mitocondriali cheie perturbați de stresul PPA și pot juca un rol în medierea modificărilor induse de PPA în morfologia și funcția mitocondrială. Sunt necesare studii viitoare pentru a caracteriza mai bine modificările temporale induse de PPA în expresia genelor și activitatea proteinelor, localizare și modificările post-translaționale. Datele noastre evidențiază complexitatea și interdependența mecanismelor de reglare care mediază răspunsul la stres mitocondrial și demonstrează utilitatea TEM și a altor tehnici de imagistică pentru studii mecanistice mai specifice.
Linia celulară SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) a fost achiziționată de la Sigma-Aldrich. Celulele SH-SY5Y au fost cultivate în mediu Dulbecco modificat Eagle/amestec de nutrienți F-12 (DMEM/F-12) și L-glutamină (SC09411, ScienCell) în flacoane de 25 cm2 suplimentate cu 20% ser fetal bovin (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) și 1% penicilină-streptomicină (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) la 37 °C, 5% CO2. Celulele au fost subcultivate la o confluență de 80% folosind 0,05% tripsină-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugate la 300 g și placate la o densitate de aproximativ 7 × 105 celule/ml. Toate experimentele au fost efectuate pe celule SH-SY5Y nediferențiate între pasajele 19-22. PPA se administrează sub formă de NaP. Se dizolvă pulberea de NaP (nr. CAS 137-40-6, formula chimică C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) în apă caldă MilliQ până la o concentrație de 1 M și se depozitează la 4 °C. În ziua tratamentului, se diluează această soluție cu PPA 1 M până la 3 mM și 5 mM PPA în mediu fără ser (DMEM/F-12 cu L-glutamină). Concentrațiile de tratament pentru toate experimentele au fost fără PPA (0 mM, control), 3 mM și 5 mM PPA. Experimentele au fost efectuate în cel puțin trei replici biologice.
Celulele SH-SY5Y au fost însămânțate în flacoane de 25 cm5 cu o rată de 5,5 × 105 celule/ml și crescute timp de 24 de ore. Tratamentul cu PPA a fost adăugat în flacon înainte de 24 de ore de incubare. Colectați peletele celulare urmând protocoalele normale de subcultură a țesuturilor de mamifere (descrise mai sus). Resuspendați peletele celulare în 100 µl de glutaraldehidă 2,5%, 1× PBS și depozitați la 4 °C până la procesare. Celulele SH-SY5Y au fost centrifugate scurt pentru a peleta celulele și a îndepărta soluția de glutaraldehidă 2,5%, 1× PBS. Resuspendați sedimentul într-un gel de agaroză 4% preparat în apă distilată (raportul dintre volumul de agaroză și cel de sediment este 1:1). Bucățile de agaroză au fost plasate pe grile pe plăci plate și acoperite cu 1-hexadecenă înainte de congelarea la presiune înaltă. Probele au fost congelate în acetonă uscată 100% la -90°C timp de 24 de ore. Temperatura a fost apoi ridicată la -80°C și s-a adăugat o soluție de 1% tetroxid de osmiu și 0,1% glutaraldehidă. Probele au fost depozitate la -80°C timp de 24 de ore. După aceasta, temperatura a fost crescută treptat la temperatura camerei pe parcursul a câteva zile: de la – 80°C la – 50°C timp de 24 de ore, la – 30°C timp de 24 de ore, la – 10°C timp de 24 de ore și în final la temperatura camerei.
După prepararea criogenică, probele au fost impregnate cu rășină și s-au realizat secțiuni ultrafine (∼100 nm) folosind un ultramicrotom Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Secțiunile au fost colorate cu 2% acetat de uranil și citrat de plumb. Probele au fost observate folosind un microscop electronic cu transmisie FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (fostul FEI), Eindhoven, Olanda) care funcționează la 200 kV (transmițător Lab6) și o cameră CCD Gatan (Gatan, Marea Britanie) echipată cu un filtru de energie Tridiem.
În fiecare replică tehnică, au fost achiziționate cel puțin 24 de imagini cu o singură celulă, pentru un total de 266 de imagini. Toate imaginile au fost analizate utilizând macrocomanda Regiunii de Interes (ROI) și macrocomanda Mitocondriei. Macrocomanda mitocondrială se bazează pe metode publicate17,31,32 și permite procesarea semiautomată în lot a imaginilor TEM în Fiji/ImageJ69. Pe scurt: imaginea este inversată și retrasă folosind scăderea fundalului cu bilă rulantă (rază de 60 de pixeli) și un filtru FFT bandpass (folosind limite superioare și inferioare de 60 și respectiv 8 pixeli) și suprimarea liniilor verticale cu o toleranță de orientare de 5%. Imaginea procesată este setată automat pe un prag utilizând un algoritm de entropie maximă și este generată o mască binară. Regiunile de imagine asociate cu ROI-urile selectate manual în imaginile TEM brute au fost extrase, caracterizând mitocondriile și excluzând membrana plasmatică și alte regiuni cu contrast ridicat. Pentru fiecare ROI extrasă, au fost analizate particule binare mai mari de 600 de pixeli, iar aria particulelor, perimetrul, axele majore și minore, diametrul Feret, rotunjimea și circularitatea au fost măsurate folosind funcțiile de măsurare încorporate ale Fiji/ImageJ. Urmând Merrill, Flippo și Strack (2017), aria 2, raportul de aspect al particulelor (raportul dintre axa majoră și cea minoră) și factorul de formă (FF) au fost calculate din aceste date, unde FF = perimetrul 2/4pi x aria. Definiția formulei parametrice poate fi găsită în Merrill, Flippo și Strack (2017). Macrocomenzile menționate sunt disponibile pe GitHub (consultați Declarația de disponibilitate a datelor). În medie, aproximativ 5.600 de particule au fost analizate per tratament PPA, pentru un total de aproximativ 17.000 de particule (datele nu sunt prezentate).
Celulele SH-SH5Y au fost plasate în vase de cultură cu 8 camere (ThermoFisher, #155411) pentru a permite aderența peste noapte și apoi incubate cu TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) și Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Imaginile au fost achiziționate folosind lasere de 405 nm și 561 nm într-un mediu de 10 minute, iar imaginile brute au fost achiziționate ca stive z conținând 10 micrografii de imagine cu un pas az de 0,2 μm între cadrele de imagine la 12 momente de timp ulterioare. Imaginile au fost colectate folosind o platformă de super-rezoluție Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania) folosind un obiectiv LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Imaginile au fost analizate în ImageJ folosind o rețea de procesare descrisă anterior și pluginul ImageJ pentru a măsura evenimentele de fuziune și fisiune, numărul mediu de structuri mitocondriale și volumul mediu mitocondrial per celulă33. Macrocomenzile MEL sunt disponibile pe GitHub (consultați Declarația de disponibilitate a datelor).
Celulele SH-SY5Y au fost crescute în plăci cu șase godeuri la o densitate de 0,3 × 106 celule/mL timp de 24 de ore înainte de tratament. ARN-ul a fost extras folosind protocolul Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) cu mici modificări: se adaugă 300 μl de tampon de liză ARN în fiecare godeu înainte de îndepărtare și se lizează fiecare probă ca etapă finală cu 30 μl de apă fără DNază/RNază eluată. Toate probele au fost verificate cantitativ și calitativ folosind un spectrofotometru UV-Vis NanoDrop ND-1000. Proteina totală din lizate celulare a fost obținută folosind 200 μl de tampon de liză RIPA, iar concentrația proteinelor a fost cuantificată folosind testul proteic Bradford70.
Sinteza ADNc a fost efectuată utilizând kitul de sinteză ADNc Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience), conform instrucțiunilor producătorului, cu unele modificări. ADNc a fost sintetizat în reacții de 20 μl utilizând 0,7 până la 1 μg de ARN total. Primerii au fost selectați din lucrările publicate anterior 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabelul S1), iar sondele însoțitoare au fost proiectate utilizând instrumentul PrimerQuest de la Integrated DNA Technologies. Toate genele de interes au fost normalizate la gena nucleară B2M. Expresia genelor STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC și OPA1 a fost măsurată prin RT-qPCR. Amestecul principal a inclus polimerază LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), primeri direcți și inversi 10 μM, ADNc și apă de calitate PCR pentru a obține un volum final de 10 μL pentru fiecare reacție. Expresia genelor de diviziune și fisiune (DRP1, MFN1/2) a fost măsurată utilizând teste multiplex TaqMan. Amestecul principal Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) a fost utilizat conform instrucțiunilor producătorului, cu modificări minore. Amestecul principal RT-qPCR multiplex include 1X polimerază LUNA Taq, primeri direcți și inversi 10 μM, sondă 10 μM, ADNc și apă de calitate PCR, rezultând un volum final de 20 μL pentru fiecare reacție. RT-qPCR a fost efectuat utilizând Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - număr de serie: R0618110). Condițiile de ciclare sunt prezentate în Tabelul S1. Toate probele de ADNc au fost amplificate în triplicat și a fost generată o curbă standard utilizând o serie de diluții de zece ori. Valorile aberante din probele triplicate cu deviație standard a pragului ciclului (Ct) >0,5 au fost eliminate din analiză pentru a asigura reproductibilitatea datelor30,72. Expresia genelor relative a fost calculată utilizând metoda 2-ΔΔCt79.
Probele de proteine ​​(60 μg) au fost amestecate cu tampon de încărcare Laemmli într-un raport de 2:1 și rulate pe un gel proteic incolor de 12% (Bio-Rad #1610184). Proteinele au fost transferate pe o membrană PVDF (fluorură de poliviniliden) (#170-84156, Bio-Rad) utilizând sistemul Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Membrana a fost blocată și incubată cu anticorpii primari corespunzători (OPA1, MFN1, MFN2 și DRP1) (diluați 1:1000) timp de 48 de ore, urmată de incubare cu anticorpi secundari (1:10.000) timp de 1 oră. Membranele au fost apoi imagistice utilizând substratul Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) și înregistrate utilizând un sistem Bio-Rad ChemiDoc MP. Pentru analiza Western blot s-a utilizat ImageLab versiunea 6.1. Gelul și blot-ul originale sunt prezentate în Figura S1. Informațiile despre anticorpi sunt furnizate în Tabelul S2.
Seturile de date sunt prezentate ca medie și eroare standard a mediei (SEM) a cel puțin trei eșantioane independente. Seturile de date au fost testate pentru normalitate folosind testul Shapiro-Wilks (cu excepția cazului în care se specifică altfel) înainte de a presupune o distribuție gaussiană și deviații standard egale și de a continua cu analizele. Pe lângă analiza setului de date, s-a folosit testul Fisher's MEL LSD (p < 0,05), ANOVA unidirecțională (media tratament vs. control) și testul Dunnett de comparații multiple pentru a determina semnificația (p < 0,05). Valorile p semnificative sunt prezentate în grafic ca *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Toate analizele statistice și graficele au fost efectuate și generate folosind GraphPad Prism 9.4.0.
Macrocomenzile Fiji/ImageJ pentru analiza imaginilor TEM sunt disponibile public pe GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Macrocomenzile Mitochondrial Event Locator (MEL) sunt disponibile public pe GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM și Vijaya A. Mitocondriile: principalii regulatori ai metabolismului, homeostaziei, stresului, îmbătrânirii și epigeneticii. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfuncție mitocondrială multifațetată în schizofrenie, complexul I ca posibilă țintă patologică. Schizofrenie. resursă. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. și Beal, MF Disfuncția mitocondrială în boala Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG și Mehta V. Mitocondriile stresate: ținte ale invaziei în boala Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF și Ferreira GK Mitocondriile și creierul: bioenergetică și multe altele. Neurotoxine. resursă. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. și colab. Mitocondriile pleiotropice: impactul mitocondriilor asupra dezvoltării neuronale și a bolilor. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. și Morais, VA Biogeneza mitocondrială în neuroni: cum și unde. Internaționalitate. J. Mohr. Știința. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. și Zhao, J. Reglarea dinamicii mitocondriale la mamifere: oportunități și provocări. front. endocrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. și Slack, RS Dinamica mitocondrială în reglarea neurogenezei: de la creierul în curs de dezvoltare la cel adult. Dezvoltare. Dinamica. 247, 47–53 (2018).