Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom afișa site-ul fără stiluri și JavaScript.
Nanoparticulele de insulină (NP) cu conținut ridicat de încărcare și-au găsit diferite aplicații în diferite forme de dozare. Această lucrare își propune să evalueze efectul proceselor de liofilizare și uscare prin pulverizare asupra structurii nanoparticulelor de chitosan încărcate cu insulină, cu sau fără manitol ca crioprotector. De asemenea, am evaluat calitatea acestor nanoparticule prin redizolvarea lor. Înainte de deshidratare, dimensiunea particulelor nanoparticulelor reticulate cu chitosan/tripolifosfat de sodiu/insulină a fost optimizată la 318 nm, PDI a fost de 0,18, eficiența de încapsulare a fost de 99,4%, iar încărcarea a fost de 25,01%. După reconstituire, toate nanoparticulele, cu excepția celor produse printr-o metodă de liofilizare fără utilizarea manitolului, și-au menținut structura sferică a particulelor. Comparativ cu nanoparticulele care conțin manitol deshidratate prin pulverizare, nanoparticulele uscate prin pulverizare fără manitol au prezentat, de asemenea, cea mai mică dimensiune medie a particulelor (376 nm) și cel mai mare conținut de încărcare. (25,02%) cu o rată de încapsulare similară (98,7%) și PDI (0,20) prin tehnici de uscare sau liofilizare. Nanoparticulele uscate prin uscare prin pulverizare fără manitol au dus, de asemenea, la cea mai rapidă eliberare de insulină și la cea mai mare eficiență a absorbției celulare. Această lucrare arată că uscarea prin pulverizare poate deshidrata nanoparticulele de insulină fără a fi nevoie de crioprotectori în comparație cu metodele convenționale de liofilizare, creând o capacitate de încărcare mai mare, cerințe mai mici de aditivi și un avantaj semnificativ al costurilor de operare.
De la descoperirea sa în 19221,2,3, insulina și preparatele sale farmaceutice au salvat viețile pacienților cu diabet zaharat de tip 1 (DZT1) și diabet zaharat de tip 2 (DZT1). Cu toate acestea, datorită proprietăților sale de proteină cu greutate moleculară mare, insulina este ușor agregată, descompusă de enzimele proteolitice și eliminată prin efectul de primă trecere. Persoanele diagnosticate cu diabet zaharat de tip 1 au nevoie de injecții cu insulină pentru tot restul vieții. Mulți pacienți diagnosticați inițial cu diabet zaharat de tip 2 necesită, de asemenea, injecții cu insulină pe termen lung. Injecțiile zilnice cu insulină reprezintă o sursă serioasă de durere și disconfort zilnic pentru aceste persoane, cu efecte negative asupra sănătății mintale. Prin urmare, alte forme de administrare a insulinei care provoacă mai puțin disconfort, cum ar fi administrarea orală de insulină, sunt studiate pe larg5, deoarece au potențialul de a restabili calitatea vieții a aproximativ 5 miliarde de persoane cu diabet zaharat din întreaga lume.
Tehnologia nanoparticulelor a oferit un progres semnificativ în încercările de a administra insulină orală4,6,7. O tehnologie care încapsulează eficient și protejează insulina de degradare pentru o livrare țintită către anumite zone ale corpului. Cu toate acestea, utilizarea formulărilor de nanoparticule are mai multe limitări, în principal din cauza problemelor de stabilitate ale suspensiilor de particule. În timpul depozitării poate apărea o anumită agregare, ceea ce reduce biodisponibilitatea nanoparticulelor încărcate cu insulină8. În plus, trebuie luată în considerare și stabilitatea chimică a matricei polimerice a nanoparticulelor și a insulinei pentru a asigura stabilitatea nanoparticulelor de insulină (NP). În prezent, tehnologia de liofilizare este standardul de aur pentru crearea de NP stabile, prevenind în același timp modificările nedorite în timpul depozitării9.
Cu toate acestea, liofilizarea necesită adăugarea de crioprotectori pentru a preveni afectarea structurii sferice a nanoparticulelor de către stresul mecanic al cristalelor de gheață. Acest lucru reduce semnificativ încărcarea nanoparticulelor de insulină după liofilizare, deoarece crioprotectorul ocupă cea mai mare parte a raportului ponderal. Prin urmare, nanoparticulele de insulină produse sunt adesea considerate nepotrivite pentru fabricarea formulărilor de pulbere uscată, cum ar fi tabletele orale și filmele orale, din cauza necesității unor cantități mari de nanoparticule uscate pentru a atinge fereastra terapeutică a insulinei.
Uscarea prin pulverizare este un proces la scară industrială binecunoscut și ieftin pentru producerea de pulberi uscate din faze lichide în industria farmaceutică10,11. Controlul asupra procesului de formare a particulelor permite încapsularea corectă a mai multor compuși bioactivi12, 13. În plus, a devenit o tehnică eficientă pentru prepararea proteinelor încapsulate pentru administrare orală. În timpul uscării prin pulverizare, apa se evaporă foarte repede, ceea ce ajută la menținerea unei temperaturi scăzute a miezului particulei11,14, permițând aplicarea acesteia pentru a încapsula componente sensibile la căldură. Înainte de uscarea prin pulverizare, materialul de acoperire trebuie omogenizat complet cu soluția care conține ingredientele încapsulate11,14. Spre deosebire de liofilizare, omogenizarea înainte de încapsulare în uscarea prin pulverizare îmbunătățește eficiența încapsulării în timpul deshidratării. Deoarece procesul de încapsulare prin uscare prin pulverizare nu necesită crioprotectori, uscarea prin pulverizare poate fi utilizată pentru a produce NP uscate cu un conținut ridicat de încărcare.
Acest studiu prezintă producerea de nanoparticule încărcate cu insulină prin reticularea chitosanului și a tripolifosfatului de sodiu utilizând o metodă de gel ionic. Gelificarea ionică este o metodă de preparare care permite producerea de nanoparticule prin interacțiuni electrostatice între două sau mai multe specii ionice în anumite condiții. Atât tehnicile de liofilizare, cât și cele de uscare prin pulverizare au fost utilizate pentru a deshidrata nanoparticulele reticulate optimizate de chitosan/tripolifosfat de sodiu/insulină. După deshidratare, morfologia lor a fost analizată prin SEM. Capacitatea lor de recombinare a fost evaluată prin măsurarea distribuției dimensiunii, a sarcinii superficiale, a PDI, a eficienței de încapsulare și a conținutului de încărcare. Calitatea nanoparticulelor resolubilizate produse prin diferite metode de deshidratare a fost, de asemenea, evaluată prin compararea protecției lor față de insulină, a comportamentului de eliberare și a eficacității absorbției celulare.
PH-ul soluției mixte și raportul dintre chitosan și insulină sunt doi factori cheie care afectează dimensiunea particulelor și eficiența de încapsulare (EE) a nanoparticulelor finale, deoarece afectează direct procesul de gelificare ionotropică. S-a demonstrat că pH-ul soluției mixte este puternic corelat cu dimensiunea particulelor și eficiența de încapsulare (Fig. 1a). După cum se arată în Fig. 1a, pe măsură ce pH-ul a crescut de la 4,0 la 6,0, dimensiunea medie a particulelor (nm) a scăzut, iar EE a crescut semnificativ, în timp ce când pH-ul a crescut la 6,5, dimensiunea medie a particulelor a început să crească, iar EE a rămas neschimbat. Pe măsură ce raportul dintre chitosan și insulină crește, crește și dimensiunea medie a particulelor. În plus, nu s-a observat nicio modificare a EE atunci când nanoparticulele au fost preparate la un raport masic chitosan/insulină mai mare de 2,5:1 (g/g) (Fig. 1b). Prin urmare, au fost utilizate condițiile optime de preparare în acest studiu (pH 6,0, raport masic chitosan/insulină de 2,5:1). pentru a prepara nanoparticule încărcate cu insulină pentru studii ulterioare. În aceste condiții de preparare, dimensiunea medie a particulelor nanoparticulelor de insulină a fost optimizată la 318 nm (Fig. 1c), PDI a fost de 0,18, eficiența de încorporare a fost de 99,4%, potențialul zeta a fost de 9,8 mv, iar încărcarea cu insulină a fost de 25,01% (m/m). Pe baza rezultatelor microscopiei electronice de transmisie (TEM), nanoparticulele optimizate au fost aproximativ sferice și discrete, cu dimensiuni relativ uniforme (Fig. 1d).
Optimizarea parametrilor nanoparticulelor de insulină: (a) efectul pH-ului asupra diametrului mediu și a eficienței de încapsulare (EE) a nanoparticulelor de insulină (preparate la un raport de masă de 5:1 între chitosan și insulină); (b) chitosan și influența raportului de masă al insulinei asupra diametrului mediu și a eficienței de încapsulare (EE) a nanoparticulelor de insulină (preparate la pH 6); (c) distribuția dimensiunii particulelor nanoparticulelor de insulină optimizate; (d) micrografie TEM a nanoparticulelor de insulină optimizate.
Este bine cunoscut faptul că chitosanul este un polielectrolit slab cu un pKa de 6,5. Este încărcat pozitiv în medii acide deoarece principala sa grupă amino este protonată de ioni de hidrogen15. Prin urmare, este adesea utilizat ca purtător pentru a încapsula macromolecule încărcate negativ. În acest studiu, chitosanul a fost utilizat pentru a încapsula insulina cu un punct izoelectric de 5,3. Deoarece chitosanul este utilizat ca material de acoperire, odată cu creșterea proporției sale, grosimea stratului exterior al nanoparticulelor crește corespunzător, rezultând o dimensiune medie a particulelor mai mare. În plus, niveluri mai ridicate de chitosan pot încapsula mai multă insulină. În cazul nostru, EE a fost cel mai mare atunci când raportul dintre chitosan și insulină a ajuns la 2,5:1 și nu a existat nicio modificare semnificativă a EE atunci când raportul a continuat să crească.
Pe lângă raportul dintre chitosan și insulină, pH-ul a jucat, de asemenea, un rol crucial în prepararea nanoparticulelor. Gan și colab. 17 au studiat efectul pH-ului asupra dimensiunii particulelor nanoparticulelor de chitosan. Aceștia au constatat o scădere continuă a dimensiunii particulelor până când pH-ul a atins 6,0 și o creștere semnificativă a dimensiunii particulelor a fost observată la pH > 6,0, ceea ce este în concordanță cu observațiile noastre. Acest fenomen se datorează faptului că odată cu creșterea pH-ului, molecula de insulină dobândește o sarcină superficială negativă, favorizând astfel interacțiunile electrostatice cu complexul chitosan/tripolifosfat de sodiu (TPP), rezultând o dimensiune mică a particulelor și un EE ridicat. Cu toate acestea, când pH-ul a fost ajustat la 6,5, grupările amino de pe chitosan au fost deprotonate, rezultând plierea chitosanului. Astfel, un pH ridicat are ca rezultat o expunere mai mică a ionilor amino la TPP și insulină, rezultând o reticulare mai mică, o dimensiune medie finală a particulelor mai mare și un EE mai mic.
Analiza proprietăților morfologice ale nanoparticulelor liofilizate și uscate prin pulverizare poate ghida selecția unor tehnici mai bune de deshidratare și formare a pulberii. Metoda preferată ar trebui să ofere stabilitate a medicamentului, formă uniformă a particulelor, încărcare mare de medicament și o bună solubilitate în soluția originală. În acest studiu, pentru a compara mai bine cele două tehnici, în timpul deshidratării s-au utilizat nanoparticule de insulină cu sau fără manitol 1%. Manitolul este utilizat ca agent de încărcare sau crioprotector în diverse formulări de pulbere uscată pentru liofilizare și uscare prin pulverizare. Pentru nanoparticulele de insulină liofilizate fără manitol, așa cum se arată în Figura 2a, s-a observat la microscopia electronică cu scanare (SEM) o structură de pulbere foarte poroasă, cu suprafețe mari, neregulate și rugoase. Puține particule discrete au fost detectate în pulbere după deshidratare (Fig. 2e). Aceste rezultate au indicat că majoritatea nanoparticulelor s-au descompus în timpul liofilizării fără niciun crioprotector. Pentru nanoparticulele de insulină liofilizate și uscate prin pulverizare care conțin 1% manitol, s-au observat nanoparticule sferice cu suprafețe netede (Fig. 2b, d, f, h). Nanoparticulele de insulină uscate prin pulverizare fără manitol au rămas sferice, dar au prezentat suprafață ridată (Fig. 2c). Suprafețele sferice și ridate sunt discutate în continuare în testele de comportament la eliberare și absorbție celulară de mai jos. Pe baza aspectului vizibil al nanoparticulelor uscate, atât nanoparticulele uscate prin pulverizare fără manitol, cât și cele liofilizate și uscate prin pulverizare cu manitol au produs pulberi fine de nanoparticule (Fig. 2f, g, h). Cu cât suprafața dintre suprafețele particulelor este mai mare, cu atât solubilitatea este mai mare și, prin urmare, cu atât rata de eliberare este mai mare.
Morfologia diferitelor nanoparticule de insulină deshidratate: (a) imagine SEM a nanoparticulelor de insulină liofilizate fără manitol; (b) imagine SEM a nanoparticulelor de insulină liofilizate cu manitol; (c) nanoparticule de insulină uscate prin pulverizare fără manitol; (d) imagine SEM a nanoparticulelor de insulină uscate prin pulverizare cu manitol; (e) imagine a pulberii de nanoparticule de insulină liofilizate fără manitol; (f) imagine a nanoparticulelor de insulină liofilizate cu manitol; (g) imagine a pulberii de nanoparticule de insulină uscate prin pulverizare fără manitol; (h) imagine a pulberii de nanoparticule de insulină uscate prin pulverizare cu manitol.
În timpul liofilizării, manitolul acționează ca un crioprotector, menținând nanoparticulele într-o formă amorfă și prevenind deteriorarea cauzată de cristalele de gheață19. În schimb, nu există nicio etapă de congelare în timpul uscării prin pulverizare. Prin urmare, manitolul nu este necesar în această metodă. De fapt, nanoparticulele uscate prin pulverizare fără manitol au produs nanoparticule mai fine, așa cum s-a descris anterior. Cu toate acestea, manitolul poate acționa în continuare ca un material de umplutură în procesul de uscare prin pulverizare pentru a da nanoparticulelor o structură mai sferică20 (Fig. 2d), ceea ce ajută la obținerea unui comportament uniform de eliberare a acestor nanoparticule încapsulate. În plus, este clar că unele particule mari pot fi detectate atât în ​​nanoparticulele de insulină liofilizate, cât și în cele uscate prin pulverizare care conțin manitol (Fig. 2b,d), ceea ce se poate datora acumulării de manitol în miezul particulei împreună cu insulina încapsulată. Strat de chitosan. Este demn de remarcat faptul că în acest studiu, pentru a se asigura că structura sferică rămâne intactă după deshidratare, raportul dintre manitol și chitosan este menținut la 5:1, astfel încât o cantitate mare de umplutură poate, de asemenea, să mărească dimensiunea particulelor nanoparticulelor uscate.
Spectroscopia FTIR-ATR (reflexie totală atenuată în infraroșu cu transformare Fourier) a caracterizat amestecul fizic de insulină liberă, chitosan, chitosan, TPP și insulină. Toate nanoparticulele deshidratate au fost caracterizate utilizând spectroscopia FTIR-ATR. În special, intensitățile benzilor de 1641, 1543 și 1412 cm-1 au fost observate în nanoparticulele încapsulate liofilizate cu manitol și în nanoparticulele uscate prin pulverizare cu și fără manitol (Fig. 3). După cum s-a raportat anterior, aceste creșteri ale rezistenței au fost asociate cu reticularea dintre chitosan, TPP și insulină. Investigarea interacțiunii dintre chitosan și insulină a arătat că în spectrele FTIR ale nanoparticulelor de chitosan încărcate cu insulină, banda de chitosan s-a suprapus cu cea a insulinei, crescând intensitatea carbonilului (1641 cm-1) și centura amină (1543 cm-1). Grupările tripolifosfat ale TPP sunt legate de grupările de amoniu din chitosan. formând o bandă la 1412 cm-1.
Spectre FTIR-ATR ale insulinei libere, chitosanului, amestecurilor fizice de chitosan/TPP/insulină și NP-urilor deshidratate prin diferite metode.
Mai mult, aceste rezultate sunt în concordanță cu cele prezentate în SEM, care au arătat că nanoparticulele încapsulate au rămas intacte atât la pulverizare, cât și la liofilizare cu manitol, dar în absența manitolului, doar uscarea prin pulverizare a produs particule încapsulate. În schimb, rezultatele spectrale FTIR-ATR ale nanoparticulelor liofilizate fără manitol au fost foarte similare cu amestecul fizic de chitosan, TPP și insulină. Acest rezultat indică faptul că legăturile încrucișate dintre chitosan, TPP și insulină nu mai sunt prezente în nanoparticulele liofilizate fără manitol. Structura nanoparticulelor a fost distrusă în timpul liofilizării fără crioprotector, ceea ce se poate observa în rezultatele SEM (Fig. 2a). Pe baza morfologiei și a rezultatelor FTIR ale nanoparticulelor de insulină deshidratate, pentru experimentele de reconstituire s-au utilizat doar nanoparticule liofilizate, uscate prin pulverizare și fără manitol, precum și nanoparticule fără manitol, datorită descompunerii nanoparticulelor fără manitol în timpul deshidratării. (discutați)
Deshidratarea este utilizată pentru depozitarea pe termen lung și reprocesarea în alte formulări. Capacitatea nanoparticulelor uscate de a se reconstitui după depozitare este esențială pentru utilizarea lor în diferite formulări, cum ar fi tablete și filme. Am observat că dimensiunea medie a particulelor nanoparticulelor de insulină uscate prin pulverizare în absența manitolului a crescut doar ușor după reconstituire. Pe de altă parte, dimensiunea particulelor nanoparticulelor de insulină uscate prin pulverizare și liofilizate cu manitol a crescut semnificativ (Tabelul 1). PDI și EE nu s-au modificat semnificativ (p > 0,05) după recombinarea tuturor nanoparticulelor din acest studiu (Tabelul 1). Acest rezultat indică faptul că majoritatea particulelor au rămas intacte după redizolvare. Cu toate acestea, adăugarea de manitol a dus la o reducere semnificativă a încărcăturii de insulină a nanoparticulelor de manitol liofilizate și uscate prin pulverizare (Tabelul 1). În schimb, conținutul de insulină al nanoparticulelor uscate prin pulverizare fără manitol a rămas același ca înainte (Tabelul 1).
Este bine cunoscut faptul că încărcarea nanoparticulelor este critică atunci când sunt utilizate în scopuri de administrare a medicamentelor. Pentru NP-urile cu încărcături mici, sunt necesare cantități foarte mari de material pentru a atinge pragul terapeutic. Cu toate acestea, vâscozitatea ridicată a unor astfel de concentrații mari de NP duce la inconveniente și dificultăți în administrarea orală și, respectiv, în formulările injectabile22. În plus, NP-urile de insulină pot fi utilizate și pentru a realiza tablete și biofilme vâscoase23, ​​24, ceea ce necesită utilizarea unor cantități mari de NP la niveluri scăzute de încărcare, rezultând tablete mari și biofilme groase care nu sunt potrivite pentru aplicații orale. Prin urmare, NP-urile deshidratate cu încărcătură mare de insulină sunt foarte dorite. Rezultatele noastre sugerează că încărcătura mare de insulină a NP-urilor uscate prin pulverizare fără manitol poate oferi multe avantaje atractive pentru aceste metode alternative de administrare.
Toate nanoparticulele deshidratate au fost păstrate la frigider timp de trei luni. Rezultatele SEM au arătat că morfologia tuturor nanoparticulelor deshidratate nu s-a modificat semnificativ în timpul depozitării de trei luni (Fig. 4). După reconstituirea în apă, toate nanoparticulele au prezentat o ușoară scădere a EE și au eliberat aproximativ o cantitate mică (~5%) de insulină în timpul perioadei de depozitare de trei luni (Tabelul 2). Cu toate acestea, dimensiunea medie a particulelor tuturor nanoparticulelor a crescut. Dimensiunea particulelor nanoparticulelor uscate prin pulverizare fără manitol a crescut la 525 nm, în timp ce cea a nanoparticulelor uscate prin pulverizare și liofilizate cu manitol a crescut la 872 și, respectiv, 921 nm (Tabelul 2).
Morfologia diferitelor nanoparticule de insulină deshidratate, depozitate timp de trei luni: (a) imagine SEM a nanoparticulelor de insulină liofilizate cu manitol; (b) imagine SEM a nanoparticulelor de insulină uscate prin pulverizare, fără manitol; (c) fără manitol, imagini SEM ale nanoparticulelor de insulină uscate prin pulverizare.
În plus, s-au observat precipitate în nanoparticulele de insulină reconstituite, uscate prin pulverizare cu manitol și liofilizate (Fig. S2). Acest lucru poate fi cauzat de particulele mari care nu se suspendă corespunzător în apă. Toate rezultatele de mai sus demonstrează că tehnica de uscare prin pulverizare poate proteja nanoparticulele de insulină de deshidratare și că se pot obține încărcături mari de nanoparticule de insulină fără agenți de umplutură sau crioprotectori.
Retenția de insulină a fost testată în mediu cu pH = 2,5 cu pepsină, tripsină și α-chimotripsină pentru a demonstra capacitatea de protecție a nanoparticulelor (NP) împotriva digestiei enzimatice după deshidratare. Retenția de insulină a NP-urilor deshidratate a fost comparată cu cea a NP-urilor proaspăt preparate, iar insulina liberă a fost utilizată ca și control negativ. În acest studiu, insulina liberă a demonstrat o eliminare rapidă a insulinei în decurs de 4 ore în toate cele trei tratamente enzimatice (Fig. 5a-c). În schimb, testarea eliminării insulinei a NP-urilor liofilizate cu manitol și a NP-urilor uscate prin pulverizare cu sau fără manitol a arătat o protecție semnificativ mai mare a acestor NP împotriva digestiei enzimatice, similară cu cea a NP-urilor de insulină proaspăt preparate (figura 1).5a-c). Cu ajutorul nanoparticulelor din pepsină, tripsină și α-chimotripsină, mai mult de 50%, 60% și, respectiv, 75% din insulină a putut fi protejată în decurs de 4 ore (Fig. 5a-c). Această acțiune de protecție împotriva insulinei... Această capacitate poate crește șansa unei absorbții mai mari a insulinei în fluxul sanguin25. Aceste rezultate sugerează că uscarea prin pulverizare cu sau fără manitol și liofilizarea cu manitol pot păstra capacitatea de protecție a insulinei a NP-urilor după deshidratare.
Protecția și comportamentul de eliberare al nanoparticulelor de insulină deshidratate: (a) protecția insulinei în soluția de pepsină; (b) protecția insulinei în soluția de tripsină; (c) protecția insulinei prin soluția de α-chimotripsină; (d) Comportamentul de eliberare al nanoparticulelor deshidratate în soluție cu pH = 2,5; (e) comportamentul de eliberare al nanoparticulelor deshidratate în soluție cu pH = 6,6; (f) comportamentul de eliberare al nanoparticulelor deshidratate în soluție cu pH = 7,0.
Nanoparticulele de insulină uscată, proaspăt preparate și reconstituite, au fost incubate în diferite soluții tampoane (pH = 2,5, 6,6, 7,0) la 37 °C, simulând mediul de pH al stomacului, duodenului și intestinului subțire superior, pentru a examina efectul insulinei asupra rezistenței la insulină. Comportamentul de eliberare în diferite medii. Fragment al tractului gastrointestinal. La pH = 2,5, nanoparticulele încărcate cu insulină și nanoparticulele de insulină uscată resolubilizate au prezentat o eliberare inițială bruscă în prima oră, urmată de o eliberare lentă în următoarele 5 ore (Fig. 5d). Această eliberare rapidă la început este cel mai probabil rezultatul desorbției rapide la suprafață a moleculelor de proteine ​​care nu sunt complet imobilizate în structura internă a particulei. La pH = 6,5, nanoparticulele încărcate cu insulină și nanoparticulele de insulină uscată reconstituită au prezentat o eliberare lină și lentă pe parcursul a 6 ore, deoarece pH-ul soluției de testat a fost similar cu cel al soluției preparate cu nanoparticule (Fig. 5e). La pH = 7, nanoparticulele au fost instabile și s-au descompus aproape complet în primele două ore (Fig. 5f). Acest lucru se datorează faptului că deprotonarea chitosanului are loc la un pH mai mare, ceea ce are ca rezultat o rețea polimerică mai puțin compactă și eliberarea de insulină încărcată.
În plus, nanoparticulele de insulină uscate prin pulverizare fără manitol au prezentat un profil de eliberare mai rapid decât alte nanoparticule deshidratate (Fig. 5d-f). Așa cum s-a descris anterior, nanoparticulele de insulină reconstituite uscate fără manitol au prezentat cea mai mică dimensiune a particulelor. Particulele mici oferă o suprafață mai mare, astfel încât cea mai mare parte a medicamentului relevant va fi la sau în apropierea suprafeței particulelor, rezultând o eliberare rapidă a medicamentului26.
Citotoxicitatea NP-urilor a fost investigată prin testul MTT. După cum se arată în Figura S4, s-a constatat că toate NP-urile deshidratate nu au un efect semnificativ asupra viabilității celulare la concentrații de 50-500 μg/ml, ceea ce sugerează că toate NP-urile deshidratate pot fi utilizate în siguranță pentru a atinge fereastra terapeutică.
Ficatul este principalul organ prin care insulina își exercită funcțiile fiziologice. Celulele HepG2 sunt o linie celulară de hepatom uman utilizată în mod obișnuit ca model in vitro de absorbție a hepatocitelor. Aici, celulele HepG2 au fost utilizate pentru a evalua absorbția celulară a nanoparticulelor (NP) deshidratate folosind metode de liofilizare și uscare prin pulverizare. Absorbția celulară prin scanare laser confocală folosind citometrie în flux și vedere după câteva ore de incubare cu insulină FITC liberă la o concentrație de 25 μg/mL, NP încărcate cu insulină FITC proaspăt preparate și NP deshidratate încărcate cu insulină FITC la concentrații egale de insulină. Au fost efectuate observații prin microscopie cantitativă (CLSM). NP liofilizate fără manitol au fost distruse în timpul deshidratării și nu au fost evaluate în acest test. Intensitățile fluorescenței intracelulare ale NP încărcate cu insulină proaspăt preparate, NP liofilizate cu manitol și NP uscate prin pulverizare cu și fără manitol (Fig. 6a) au fost de 4,3, 2,6, 2,4, și de 4,1 ori mai mari decât cele libere. Grupul FITC-insulină, respectiv (Fig. 6b). Aceste rezultate sugerează că insulina încapsulată este mai puternică în absorbția celulară decât insulina liberă, în principal datorită dimensiunii mai mici a nanoparticulelor încărcate cu insulină produse în studiu.
Absorbția celulelor HepG2 după 4 ore de incubare cu NP proaspăt preparate și NP deshidratate: (a) Distribuția absorbției de insulină FITC de către celulele HepG2. (b) Media geometrică a intensităților fluorescenței analizate prin citometrie în flux (n = 3), *P < 0,05 comparativ cu insulina liberă.
De asemenea, imaginile CLSM au arătat că intensitățile fluorescenței FITC ale NP-urilor încărcate cu insulină FITC proaspăt preparate și ale NP-urilor uscate prin pulverizare încărcate cu insulină FITC (fără manitol) au fost mult mai puternice decât cele ale celorlalte probe (Fig. 6a). În plus, odată cu adăugarea de manitol, vâscozitatea mai mare a soluției a crescut rezistența la absorbția celulară, rezultând o proliferare scăzută a insulinei. Aceste rezultate sugerează că NP-urile uscate prin pulverizare fără manitol au prezentat cea mai mare eficiență de absorbție celulară, deoarece dimensiunea particulelor lor a fost mai mică decât cea a NP-urilor liofilizate după redizolvare.
Chitosanul (greutate moleculară medie 100 kDa, 75–85% deacetilat) a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Tripolifosfatul de sodiu (TPP) a fost achiziționat de la VWR (Radnor, Pennsylvania, SUA). Insulina umană recombinantă utilizată în acest studiu a fost de la Fisher Scientific (Waltham, MA, SUA). Insulina umană marcată cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) și diclorhidratul de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Linia celulară HepG2 a fost obținută de la ATCC (Manassas, Virginia, SUA). Toți ceilalți reactivi au fost de grad analitic sau cromatografic.
Se prepară o soluție de CS de 1 mg/ml prin dizolvarea acesteia în apă bidistilată (apă DD) conținând 0,1% acid acetic. Se prepară soluții de 1 mg/ml de TPP și insulină prin dizolvarea lor în apă DD și respectiv 0,1% acid acetic. Preemulsia a fost preparată cu un omogenizator de mare viteză Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, SUA). Procesul de preparare este următorul: mai întâi, se adaugă 2 ml de soluție TPP la 4 ml de soluție de insulină, iar amestecul este agitat timp de 30 de minute și complet amestecat. Apoi, soluția amestecată a fost adăugată picătură cu picătură în soluția CS printr-o seringă sub agitare la viteză mare (10.000 rpm). Amestecurile au fost ținute sub agitare la viteză mare (15.000 rpm) într-o baie de gheață timp de 30 de minute și au fost ajustate la un anumit pH pentru a obține nanoparticule de insulină reticulate. Pentru a omogeniza în continuare și a reduce dimensiunea particulelor de nanoparticule de insulină, acestea au fost sonicate pentru... încă 30 de minute într-o baie de gheață folosind un sonicator cu sondă (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germania).
NPS-urile de insulină au fost testate pentru diametrul mediu Z, indicele de polidispersie (PDI) și potențialul zeta utilizând măsurători de împrăștiere dinamică a luminii (DLS) cu un Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) prin diluarea lor în apă DD la 25°C. Morfologia și distribuția dimensiunilor au fost caracterizate cu un microscop electronic de transmisie (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Japonia), iar imaginile au fost ulterior analizate utilizând software-ul de imagistică Hitachi (Hitachi, Tokyo, Japonia). Pentru a evalua eficiența de încapsulare (EE) și capacitatea de încărcare (LC) a NP-urilor de insulină, acestea au fost pipetate în tuburi de ultrafiltrare cu o limită de greutate moleculară de 100 kDa și centrifugate la 500 xg timp de 30 de minute. Insulina neîncapsulată din filtrat a fost cuantificată utilizând un sistem HPLC Agilent seria 1100 (Agilent, Santa Clara, California, SUA), format dintr-o pompă cuaternară, un autosampler, un încălzitor de coloană, și detector DAD. Insulina a fost analizată cu o coloană C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, SUA) și detectată la 214 nm. Faza mobilă a fost acetonitril și apă, conținând 0,1% TFA, rapoarte de gradient de la 10/90 la 100/0 și a funcționat timp de 10 minute. Faza mobilă a fost pompată la un debit de 1,0 ml/min. Temperatura coloanei a fost setată la 20 °C. Calculați procentele de EE și LC folosind ecuațiile (1) și (2).
Diverse raporturi CS/insulină, cuprinse între 2,0 și 4,0, au fost testate pentru a optimiza formarea nanoparticulelor de insulină. În timpul preparării au fost adăugate cantități diferite de soluție CS, amestecul insulină/TPP menținându-se constant. Nanoparticulele de insulină au fost preparate la un pH cuprins între 4,0 și 6,5, controlând cu atenție pH-ul amestecului după adăugarea tuturor soluțiilor (insulină, TPP și CS). EE și dimensiunea particulelor nanoparticulelor de insulină au fost evaluate la diferite valori ale pH-ului și raporturi masice CS/insulină pentru a optimiza formarea nanoparticulelor de insulină.
Nanoparticulele de insulină optimizate au fost plasate pe recipientul de aluminiu și acoperite cu hârtie absorbantă, strânsă cu bandă adezivă. Ulterior, recipientele înșurubate au fost plasate într-un liofilizator Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, SUA) echipat cu un uscător cu tavă. Temperatura și presiunea de vid au fost setate la -10 °C și 0,350 Torr pentru primele 2 ore și la 0 °C și 0,120 Torr pentru restul de 22 de ore din cele 24 de ore pentru a obține nanoparticule de insulină uscate.
Uscătorul prin pulverizare Buchi Mini B-290 (BÜCHI, Flawil, Elveția) a fost utilizat pentru a genera insulină încapsulată. Parametrii de uscare selectați au fost: temperatura 100 °C, debitul de alimentare 3 L/min și debitul de gaz 4 L/min.
Nanoparticulele de insulină înainte și după deshidratare au fost caracterizate utilizând spectroscopia FTIR-ATR. Nanoparticulele deshidratate, precum și insulina liberă și chitosanul au fost analizate utilizând un spectrofotometru FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, SUA) echipat cu un accesoriu universal de eșantionare ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, SUA). Mediile semnalelor au fost obținute din 16 scanări la o rezoluție de 4 cm2 în intervalul de frecvență 4000-600 cm2.
Morfologia nanoparticulelor de insulină uscate a fost evaluată prin imagini SEM ale nanoparticulelor de insulină liofilizate și uscate prin pulverizare, capturate de un microscop electronic cu fascicul de ioni focalizat Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, SUA). Principalul parametru utilizat a fost tensiunea de 5 keV și curentul de 30 mA.
Toate nanoparticulele de insulină deshidratate au fost redizolvate în apă deshidratată. Dimensiunea particulelor, PDI, EE și LC au fost testate din nou folosind aceeași metodă menționată anterior pentru a evalua calitatea acestora după deshidratare. Stabilitatea nanoparticulelor de anhidroinsulină a fost, de asemenea, măsurată prin testarea proprietăților nanoparticulelor după depozitare prelungită. În acest studiu, toate nanoparticulele au fost depozitate la frigider timp de trei luni după deshidratare. După trei luni de depozitare, nanoparticulele au fost testate pentru dimensiunea morfologică a particulelor, PDI, EE și LC.
Se dizolvă 5 mL de NP reconstituite în 45 mL conținând lichid gastric simulat (pH 1,2, conținând 1% pepsină), lichid intestinal (pH 6,8, conținând 1% tripsină) sau soluție de chimotripsină (100 g/mL, în tampon fosfat, pH 7,8) pentru a evalua eficacitatea insulinei în protejarea NP-urilor după deshidratare. Acestea au fost incubate la 37°C cu o viteză de agitare de 100 rpm. 500 μL din soluție au fost colectați la momente diferite, iar concentrația de insulină a fost determinată prin HPLC.
Comportamentul de eliberare in vitro a nanoparticulelor de insulină proaspăt preparate și deshidratate a fost testat prin metoda pungii de dializă (praiză de greutate moleculară 100 kDa, Spectra Por Inc.). Nanoparticulele uscate proaspăt preparate și reconstituite au fost dializate în fluide la pH 2,5, pH 6,6 și pH 7,0 (soluție salină tamponată cu fosfat 0,1 M, PBS) pentru a simula mediul de pH al stomacului, duodenului și respectiv intestinului subțire superior. Toate probele au fost incubate la 37 °C cu agitare continuă la 200 rpm. Se aspiră fluidul din afara pungii de dializă de 5 ml la următorii timpi: 0,5, 1, 2, 3, 4 și 6 ore și se completează imediat volumul cu dializat proaspăt. Contaminarea cu insulină din fluid a fost analizată prin HPLC, iar rata de eliberare a insulinei din nanoparticule a fost calculată din raportul dintre insulina liberă eliberată și insulina totală încapsulată în nanoparticule (Ecuația 3).
Celulele HepG2 din linia celulară de carcinom hepatocelular uman au fost cultivate în plăci cu diametrul de 60 mm folosind mediu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) conținând 10% ser fetal bovin, 100 UI/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină29. Culturile au fost menținute la 37°C, 95% umiditate relativă și 5% CO2. Pentru testele de absorbție, celulele HepG2 au fost însămânțate la 1 × 105 celule/ml pe un sistem de lame cu cameră Nunc Lab-Tek cu 8 godeuri (Thermo Fisher, NY, SUA). Pentru testele de citotoxicitate, acestea au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri (Corning, NY, SUA) la o densitate de 5 × 104 celule/ml.
Testul MTT a fost utilizat pentru a evalua citotoxicitatea nanoparticulelor de insulină proaspăt preparate și deshidratate30. Celulele HepG2 au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 5 × 104 celule/mL și cultivate timp de 7 zile înainte de testare. Nanoparticulele de insulină au fost diluate la diferite concentrații (50 până la 500 μg/mL) în mediu de cultură și apoi administrate celulelor. După 24 de ore de incubare, celulele au fost spălate de 3 ori cu PBS și incubate cu mediu conținând 0,5 mg/ml MTT timp de încă 4 ore. Citotoxicitatea a fost evaluată prin măsurarea reducerii enzimatice a MTT galben de tetrazoliu la formazan violet la 570 nm utilizând un cititor de plăci spectrofotometru Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Elveția).
Eficiența absorbției celulare a NP-urilor a fost testată prin microscopie confocală cu scanare laser și analiză prin citometrie în flux. Fiecare godeu al sistemului de lame cu cameră Nunc Lab-Tek a fost tratat cu insulină FITC liberă, NP încărcate cu insulină FITC și s-au reconstituit 25 μg/mL de NP-uri de insulină FITC deshidratate la aceeași concentrație și incubate timp de 4 ore. Celulele au fost spălate de 3 ori cu PBS și fixate cu paraformaldehidă 4%. Nucleii au fost colorați cu 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Localizarea insulinei a fost observată utilizând un microscop confocal cu scanare laser/doi fotoni Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japonia). Pentru analiza prin citometrie în flux, s-au adăugat aceleași concentrații de 10 μg/mL insulină FITC liberă, NP încărcate cu insulină FITC și NP-uri de insulină FITC deshidratate resolubilizate. Plăci cu 96 de godeuri însămânțate cu celule HepG2 și incubate timp de 4 ore. După 4 ore de incubare, celulele au fost îndepărtate și spălate de 3 ori cu FBS. 5 × 104 celule per probă au fost analizate cu un citometru de flux BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Statele Unite).
Toate valorile sunt exprimate ca medie ± deviație standard. Comparațiile între toate grupurile au fost evaluate folosind ANOVA cu o singură direcție sau testul t cu IBM SPSS Statistics 26 pentru Mac (IBM, Endicott, New York, SUA), iar o valoare p < 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.
Acest studiu demonstrează flexibilitatea și capacitatea uscării prin pulverizare de a deshidrata nanoparticulele de chitosan/TPP/insulină reticulate, cu o reconstituire mai bună în comparație cu metodele standard de liofilizare utilizând agenți de încărcare sau crioprotectori, cu o capacitate și o capacitate de încărcare mai mare. Nanoparticulele de insulină optimizate au produs o dimensiune medie a particulelor de 318 nm și o eficiență de încapsulare de 99,4%. Rezultatele SEM și FTIR după deshidratare au arătat că structura sferică s-a menținut doar în nanoparticulele uscate prin pulverizare cu și fără manitol și liofilizate cu manitol, dar nanoparticulele liofilizate fără manitol s-au descompus în timpul deshidratării. În testul de capacitate de reconstituire, nanoparticulele de insulină uscate prin pulverizare fără manitol au prezentat cea mai mică dimensiune medie a particulelor și cea mai mare încărcare la reconstituire. Comportamentele de eliberare ale tuturor acestor nanoparticule deshidratate au arătat că au fost eliberate rapid în soluții cu pH = 2,5 și pH = 7 și foarte stabile în soluții cu pH = 6,5. Comparativ cu alte nanoparticule deshidratate redizolvate, nanoparticulele... Uscarea prin pulverizare fără manitol a prezentat cea mai rapidă eliberare. Acest rezultat este în concordanță cu cel observat în testul de absorbție celulară, deoarece nanoparticulele de insulină uscate prin pulverizare în absența manitolului au menținut aproape complet eficiența de absorbție celulară a nanoparticulelor proaspăt preparate. Aceste rezultate sugerează că nanoparticulele de insulină uscate preparate prin uscare prin pulverizare fără manitol sunt cele mai potrivite pentru procesarea ulterioară în alte forme de dozare anhidre, cum ar fi tablete orale sau pelicule bioadezive.
Din cauza unor probleme de proprietate intelectuală, seturile de date generate și/sau analizate în cadrul studiului actual nu sunt disponibile publicului, dar sunt disponibile de la autorii respectivi la cerere rezonabilă.
Kagan, A. Diabetul de tip 2: origini sociale și științifice, complicații medicale și implicații pentru pacienți și alte persoane. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. și Jiang, P. Dezvoltarea încapsulării insulinei: este posibilă administrarea orală acum? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. și Dass, CR Progrese recente în sistemele de administrare orală a lipozomilor încărcați cu insulină pentru tratamentul diabetului. Interpretation. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).