Articolul face parte din tema de cercetare „Îmbunătățirea rezistenței leguminoaselor la agenți patogeni și dăunători”, vezi toate cele 5 articole
Agentul cauzal al necrozei bolii fungice a plantelor, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, utilizează o strategie multi-nivel pentru a infecta diferite plante gazdă. Acest studiu propune utilizarea diaminei L-ornitine, un aminoacid non-proteic care stimulează sinteza altor aminoacizi esențiali, ca strategie alternativă de gestionare pentru a spori răspunsurile moleculare, fiziologice și biochimice ale Phaseolus vulgaris L. la mucegaiul alb cauzat de Pseudomonas sclerotiorum. Experimentele in vitro au arătat că L-ornitina a inhibat semnificativ creșterea micelială a S. pyrenoidosa într-un mod dependent de doză. Mai mult, ar putea reduce semnificativ severitatea mucegaiului alb în condiții de seră. În plus, L-ornitina a stimulat creșterea plantelor tratate, indicând faptul că concentrațiile testate de L-ornitină nu au fost fitotoxice pentru plantele tratate. În plus, L-ornitina a amplificat expresia antioxidanților non-enzimatici (fenoli și flavonoide solubile totale) și a antioxidanților enzimatici (catalază (CAT), peroxidază (POX) și polifenol oxidază (PPO)) și a crescut expresia a trei gene legate de antioxidanți (PvCAT1, PvSOD și PvGR). Mai mult, analiza in silico a relevat prezența unei presupuse proteine ​​oxaloacetat acetilhidrolază (SsOAH) în genomul S. sclerotiorum, care a fost foarte similară cu proteinele oxaloacetat acetilhidrolază (SsOAH) ale Aspergillus fijiensis (AfOAH) și Penicillium sp. (PlOAH) în ceea ce privește analiza funcțională, domeniile conservate și topologia. Interesant este că adăugarea de L-ornitine la mediul de bulion de dextroză din cartofi (PDB) a scăzut semnificativ expresia genei SsOAH în miceliile de S. sclerotiorum. În mod similar, aplicarea exogenă de L-ornitină a scăzut semnificativ expresia genei SsOAH în miceliile fungice colectate de la plantele tratate. În cele din urmă, aplicarea de L-ornitină a scăzut semnificativ secreția de acid oxalic atât în ​​mediul PDB, cât și în frunzele infectate. În concluzie, L-ornitina joacă un rol cheie în menținerea stării redox, precum și în îmbunătățirea răspunsului de apărare al plantelor infectate. Rezultatele acestui studiu pot ajuta la dezvoltarea de metode inovatoare și ecologice pentru a controla mucegaiul alb și a atenua impactul acestuia asupra producției de fasole și a altor culturi.
Mucegaiul alb, cauzat de ciuperca necrotrofă Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, este o boală devastatoare, care reduce randamentul și reprezintă o amenințare serioasă pentru producția globală de fasole (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum este unul dintre cei mai dificil de controlat agenți patogeni fungici ai plantelor, transmiși din sol, cu o gamă largă de gazde de peste 600 de specii de plante și capacitatea de a macera rapid țesuturile gazdă într-un mod nespecific (Liang și Rollins, 2018). În condiții nefavorabile, aceasta trece printr-o fază critică a ciclului său de viață, rămânând latentă pentru perioade lungi de timp sub formă de structuri negre, dure, asemănătoare semințelor, numite „scleroți” în sol sau sub formă de excrescențe albe, pufoase în miceliul sau măduva tulpinii plantelor infectate (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum este capabilă să formeze scleroți, ceea ce îi permite să supraviețuiască în câmpurile infectate pentru perioade lungi de timp și să persiste în timpul bolii (Schwartz et al., 2005). Scleroții sunt bogați în nutrienți, pot persista în sol pentru perioade lungi de timp și servesc drept inocul principal pentru infecțiile ulterioare (Schwartz et al., 2005). În condiții favorabile, scleroții germinează și produc spori transportați prin aer care pot infecta toate părțile supraterane ale plantei, inclusiv, dar fără a se limita la, flori, tulpini sau păstăi (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum folosește o strategie pe mai multe niveluri pentru a infecta plantele gazdă, implicând o serie de evenimente coordonate, de la germinarea scleroțialului până la dezvoltarea simptomelor. Inițial, S. sclerotiorum produce spori suspendați (numiți ascospori) din structuri asemănătoare ciupercilor numite apotecii, care devin transportați prin aer și se dezvoltă în scleroți nemotili pe resturile vegetale infectate (Bolton et al., 2006). Ciuperca secretă apoi acid oxalic, un factor de virulență, pentru a controla pH-ul peretelui celular al plantei, a promova degradarea enzimatică și invazia țesuturilor (Hegedus și Rimmer, 2005) și a suprima explozia oxidativă a plantei gazdă. Acest proces de acidificare slăbește peretele celular al plantei, oferind un mediu favorabil pentru funcționarea normală și eficientă a enzimelor de degradare a peretelui celular fungic (CWDE), permițând agentului patogen să depășească bariera fizică și să pătrundă în țesuturile gazdă (Marciano et al., 1983). Odată penetrată, S. sclerotiorum secretă o serie de CWDE-uri, cum ar fi poligalacturonaza și celulaza, care facilitează diseminarea sa în țesuturile infectate și provoacă necroză tisulară. Progresia leziunilor și a covorașelor hifale duce la simptomele caracteristice ale mucegaiului alb (Hegedus și Rimmer, 2005). Între timp, plantele gazdă recunosc modelele moleculare asociate agenților patogeni (PAMP) prin intermediul receptorilor de recunoaștere a modelelor (PRR), declanșând o serie de evenimente de semnalizare care, în cele din urmă, activează răspunsurile de apărare.
În ciuda deceniilor de eforturi de control al bolilor, deficitul de germeni rezistenți adecvati persistă la fasole, ca și în alte culturi comerciale, din cauza rezistenței, supraviețuirii și adaptabilității agentului patogen. Prin urmare, gestionarea bolilor este extrem de dificilă și necesită o strategie integrată, multifațetată, care include o combinație de practici culturale, control biologic și fungicide chimice (O'Sullivan et al., 2021). Controlul chimic al mucegaiului alb este cel mai eficient, deoarece fungicidele, atunci când sunt aplicate corect și la momentul potrivit, pot controla eficient răspândirea bolii, pot reduce severitatea infecției și pot minimiza pierderile de randament. Cu toate acestea, utilizarea excesivă și dependența excesivă de fungicide pot duce la apariția unor tulpini rezistente de S. sclerotiorum și pot avea un impact negativ asupra organismelor nevizate, a sănătății solului și a calității apei (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Prin urmare, găsirea unor alternative ecologice a devenit o prioritate maximă.
Poliaminele (AP), cum ar fi putrescina, spermidina, spermina și cadaverina, pot servi drept alternative promițătoare împotriva agenților patogeni ai plantelor din sol, reducând astfel complet sau parțial utilizarea fungicidelor chimice periculoase (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). La plantele superioare, AP sunt implicate în multe procese fiziologice, inclusiv, dar fără a se limita la, diviziunea celulară, diferențierea și răspunsul la stresuri abiotice și biotice (Killiny și Nehela, 2020). Acestea pot acționa ca antioxidanți, pot ajuta la eliminarea speciilor reactive de oxigen (ROS), pot menține homeostazia redox (Nehela și Killiny, 2023), pot induce gene legate de apărare (Romero et al., 2018), pot regla diverse căi metabolice (Nehela și Killiny, 2023), pot modula fitohormonii endogeni (Nehela și Killiny, 2019), pot stabili rezistență sistemică dobândită (SAR) și pot regla interacțiunile plantă-agent patogen (Nehela și Killiny, 2020; Asija și colab., 2022; Czerwoniec, 2022). Este demn de remarcat faptul că mecanismele și rolurile specifice ale acidului pirolitic (PA) în apărarea plantelor variază în funcție de speciile de plante, agenții patogeni și condițiile de mediu. Cea mai abundentă PA din plante este biosintetizată din poliamina esențială L-ornitină (Killiny și Nehela, 2020).
L-ornitina joacă roluri multiple în creșterea și dezvoltarea plantelor. De exemplu, studii anterioare au arătat că la orez (Oryza sativa), ornitina poate fi asociată cu reciclarea azotului (Liu et al., 2018), randamentul, calitatea și aroma orezului (Lu et al., 2020) și răspunsul la stresul hidric (Yang et al., 2000). În plus, aplicarea exogenă a L-ornitinei a îmbunătățit semnificativ toleranța la secetă la sfecla de zahăr (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) și a atenuat stresul salin la plantele de ceapă (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu și Çavuşoǧlu, 2021) și caju (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Rolul potențial al L-ornitinei în apărarea împotriva stresului abiotic se poate datora implicării sale în acumularea de prolină la plantele tratate. De exemplu, genele legate de metabolismul prolinei, cum ar fi genele ornitin delta aminotransferază (delta-OAT) și prolin dehidrogenază (ProDH1 și ProDH2), au fost raportate anterior ca fiind implicate în apărarea Nicotiana benthamiana și Arabidopsis thaliana împotriva tulpinilor non-gazdă de Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar și Mysore, 2012). Pe de altă parte, ornitin decarboxilaza fungică (ODC) este necesară pentru creșterea agenților patogeni (Singh et al., 2020). Vizarea ODC-ului de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici prin intermediul silențierii genice induse de gazdă (HIGS) a sporit semnificativ rezistența plantelor de tomate la ofilirea cauzată de Fusarium (Singh et al., 2020). Cu toate acestea, rolul potențial al aplicării ornitinei exogene împotriva stresurilor biotice, cum ar fi fitopatogenii, nu a fost bine studiat. Mai important, efectele ornitinei asupra rezistenței la boli și fenomenele biochimice și fiziologice asociate rămân în mare parte neexplorate.
Înțelegerea complexității infecției cu S. sclerotiorum a leguminoaselor este importantă pentru dezvoltarea unor strategii eficiente de control. În acest studiu, ne-am propus să identificăm rolul potențial al diaminei L-ornitinei ca factor cheie în îmbunătățirea mecanismelor de apărare și a rezistenței plantelor de leguminoase la infecția cu Sclerotinia sclerotiorum. Ipoteza noastră este că, pe lângă îmbunătățirea răspunsurilor de apărare ale plantelor infectate, L-ornitina joacă și un rol cheie în menținerea stării redox. Propunem că efectele potențiale ale L-ornitinei sunt legate de reglarea mecanismelor de apărare antioxidante enzimatice și non-enzimatice și de interferența cu factorii de patogenitate/virulență fungică și proteinele asociate. Această funcționalitate dublă a L-ornitinei o face un candidat promițător pentru o strategie durabilă de atenuare a impactului mucegaiului alb și de sporire a rezistenței culturilor comune de leguminoase la acest agent patogen fungic puternic. Rezultatele prezentului studiu pot ajuta la dezvoltarea unor metode inovatoare și ecologice pentru controlul mucegaiului alb și atenuarea impactului acestuia asupra producției de leguminoase.
În acest studiu, o varietate comercială susceptibilă de fasole comună, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), a fost utilizată ca material experimental. Semințele sănătoase au fost furnizate cu amabilitate de către Departamentul de Cercetare a Leguminoaselor, Institutul de Cercetare a Culturilor de Câmp (FCRI), Centrul de Cercetare Agricolă (ARC), Egipt. Cinci semințe au fost semănate în ghivece de plastic (diametru interior 35 cm, adâncime 50 cm) umplute cu sol infectat cu S. sclerotiorum în condiții de seră (25 ± 2 °C, umiditate relativă 75 ± 1%, 8 ore de lumină/16 ore de întuneric). La 7-10 zile după semănat (DPS), răsadurile au fost rărite pentru a lăsa doar două răsaduri cu creștere uniformă și trei frunze complet extinse în fiecare ghiveci. Toate plantele în ghiveci au fost udate o dată la două săptămâni și fertilizate lunar la rata recomandată pentru soiul dat.
Pentru a prepara o concentrație de 500 mg/L de L-ornitindiamină (cunoscută și sub denumirea de acid (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), s-au dizolvat mai întâi 50 mg în 100 mL de apă distilată sterilă. Soluția stoc a fost apoi diluată și utilizată în experimente ulterioare. Pe scurt, au fost testate in vitro șase serii de concentrații de L-ornitină (12,5, 25, 50, 75, 100 și 125 mg/L). În plus, s-a utilizat apă distilată sterilă ca și control negativ (Mock), iar fungicidul comercial „Rizolex-T” pulbere umectabilă 50% (toclofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Guvernoratul Gharbia, Egipt) a fost utilizat ca și control pozitiv. Fungicidul comercial „Rizolex-T” a fost testat in vitro la cinci concentrații (2, 4, 6, 8 și 10 mg/l).
Probe de tulpini și păstăi de fasole comună care prezentau simptome tipice de mucegai alb (rata de infestare: 10-30%) au fost colectate de la ferme comerciale. Deși majoritatea materialelor vegetale infectate au fost identificate după specie/soi (soi comercial sensibil Giza 3), altele, în special cele obținute de pe piețele locale, erau din specii necunoscute. Materialele infectate colectate au fost mai întâi dezinfectate la suprafață cu soluție de hipoclorit de sodiu 0,5% timp de 3 minute, apoi clătite de mai multe ori cu apă distilată sterilă și șterse cu hârtie de filtru sterilă pentru a îndepărta excesul de apă. Organele infectate au fost apoi tăiate în bucăți mici din țesutul mijlociu (între țesuturile sănătoase și cele infectate), cultivate pe mediu agar-dextroză de cartofi (PDA) și incubate la 25 ± 2 °C cu un ciclu de 12 ore de lumină/12 ore de întuneric timp de 5 zile pentru a stimula formarea scleroților. Metoda vârfului micelial a fost utilizată și pentru purificarea izolatelor fungice din culturi mixte sau contaminate. Izolatul fungic purificat a fost identificat mai întâi pe baza caracteristicilor sale morfologice culturale și apoi confirmat a fi S. sclerotiorum pe baza caracteristicilor microscopice. În final, toate izolatele purificate au fost testate pentru patogenitate pe soiul de fasole comună Giza 3, sensibil, pentru a îndeplini postulatele lui Koch.
În plus, cel mai invaziv izolat de S. sclerotiorum (izolatul nr. 3) a fost confirmat suplimentar pe baza secvențierii cu spacer transcris intern (ITS), așa cum este descris de White și colab., 1990; Baturo-Ciesniewska și colab., 2017. Pe scurt, izolatele au fost cultivate în bulion de dextroză de cartofi (PDB) și incubate la 25 ± 2 °C timp de 5-7 zile. Miceliul fungic a fost apoi colectat, filtrat printr-o tifon, spălat de două ori cu apă sterilă și uscat cu hârtie de filtru sterilă. ADN-ul genomic a fost izolat folosind kitul Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah și colab., 2022, 2024). Regiunea ADNr ITS a fost apoi amplificată folosind perechea specifică de primeri ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; dimensiune așteptată: 540 pb) (Baturo-Ciesniewska și colab., 2017). Produsele PCR purificate au fost trimise pentru secvențiere (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Secvențele ADNr ITS au fost secvențiate bidirecțional folosind metoda de secvențiere Sanger. Secvențele interogare asamblate au fost apoi comparate cu cele mai recente date din GenBank și Centrul Național pentru Informații Biotehnologice (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) folosind software-ul BLASTn. Secvența interogare a fost comparată cu alte 20 de tulpini/izolate de S. sclerotiorum recuperate din cele mai recente date din NCBI GenBank (Tabelul suplimentar S1) folosind ClustalW în Pachetul de Analiză Genetică Evoluționară Moleculară (MEGA-11; versiunea 11) (Kumar și colab., 2024). Analiza evolutivă a fost efectuată utilizând metoda probabilității maxime și modelul general de substituție nucleotidică reversibilă în timp (Nei și Kumar, 2000). Este prezentat arborele cu cea mai mare log-verosimilitate. Arborele inițial pentru căutarea euristică este selectat prin alegerea arborelui cu cea mai mare log-verosimilitate între arborele neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) și arborele cu parsimonie maximă (MP). Arborele NJ a fost construit folosind o matrice de distanță pereche calculată folosind modelul general reversibil în timp (Nei și Kumar, 2000).
Activitatea antibacteriană a L-ornitinei și a bactericidului „Rizolex-T” a fost determinată in vitro prin metoda difuziei în agar. Metodă: Se preia cantitatea corespunzătoare din soluția stoc de L-ornitină (500 mg/L) și se amestecă bine cu 10 ml de mediu nutritiv PDA pentru a prepara soluții cu concentrații finale de 12,5, 25, 50, 75, 100 și respectiv 125 mg/L. Cinci concentrații de fungicid „Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 și 10 mg/L) și apă distilată sterilă au fost utilizate ca martor. După solidificarea mediului, un dop micelial proaspăt preparat din cultura de Sclerotinia sclerotiorum, cu diametrul de 4 mm, a fost transferat în centrul plăcii Petri și cultivat la 25±2°C până când miceliul a acoperit întreaga placă Petri de control, după care s-a înregistrat creșterea fungică. Calculați procentul de inhibare a creșterii radiale a S. sclerotiorum folosind ecuația 1:
Experimentul a fost repetat de două ori, cu șase replici biologice pentru fiecare grup de control/experimental și cinci ghivece (două plante per ghiveci) pentru fiecare replică biologică. Fiecare replică biologică a fost analizată de două ori (două replici tehnice) pentru a asigura acuratețea, fiabilitatea și reproductibilitatea rezultatelor experimentale. În plus, s-a utilizat analiza de regresie probit pentru a calcula concentrația inhibitorie semi-maximală (IC50) și IC99 (Prentice, 1976).
Pentru a evalua potențialul L-ornitinei în condiții de seră, au fost efectuate două experimente consecutive în ghivece. Pe scurt, ghivecele au fost umplute cu sol argilo-nisipos sterilizat (3:1) și inoculate cu o cultură proaspăt preparată de S. sclerotiorum. Mai întâi, cel mai invaziv izolat de S. sclerotiorum (izolatul nr. 3) a fost cultivat prin tăierea unui scleroțiu în jumătate, așezarea lui cu fața în jos pe un PDA și incubarea la 25°C în întuneric constant (24 h) timp de 4 zile pentru a stimula creșterea miceliului. Apoi, patru dopuri de agar cu diametrul de 5 mm au fost prelevate de la marginea anterioară și inoculate cu 100 g dintr-un amestec steril de tărâțe de grâu și orez (1:1, v/v), iar toate baloanele au fost incubate la 25 ± 2°C într-un ciclu de 12 ore lumină/12 ore întuneric timp de 5 zile pentru a stimula formarea scleroților. Conținutul tuturor baloanelor a fost amestecat bine pentru a asigura omogenitatea înainte de adăugarea solului. Apoi, în fiecare ghiveci s-au adăugat 100 g din amestecul de tărâțe colonizatoare pentru a asigura o concentrație constantă de agenți patogeni. Ghivecele inoculate au fost udate pentru a activa creșterea fungică și plasate în condiții de seră timp de 7 zile.
Cinci semințe din soiul Giza 3 au fost apoi semănate în fiecare ghiveci. Pentru ghivecele tratate cu L-ornitină și fungicidul Rizolex-T, semințele sterilizate au fost mai întâi înmuiate timp de două ore într-o soluție apoasă a celor doi compuși, cu o concentrație finală de IC99 de aproximativ 250 mg/L și, respectiv, 50 mg/L, și apoi uscate la aer timp de o oră înainte de semănat. Pe de altă parte, semințele au fost înmuiate în apă distilată sterilă ca martor negativ. După 10 zile, înainte de prima udare, răsadurile au fost rărite, lăsând doar două răsaduri pure în fiecare ghiveci. În plus, pentru a asigura infecția cu S. sclerotiorum, tulpinile de fasole aflate în același stadiu de dezvoltare (10 zile) au fost tăiate în două locații diferite folosind un bisturiu sterilizat și aproximativ 0,5 g din amestecul de tărâțe colonizator au fost plasate în fiecare rană, urmată de umiditate ridicată pentru a stimula infecția și dezvoltarea bolii la toate plantele inoculate. Plantele de control au fost rănite în mod similar, iar o cantitate egală (0,5 g) de amestec steril de tărâțe, necolonizat, a fost plasată în rană și menținută la umiditate ridicată pentru a simula mediul propice dezvoltării bolii și a asigura consecvența între grupurile de tratament.
Metoda de tratament: Răsadurile de fasole au fost udate cu 500 ml de soluție apoasă de L-ornitină (250 mg/l) sau cu fungicidul Rizolex-T (50 mg/l) prin irigarea solului, apoi tratamentul a fost repetat de trei ori la un interval de 10 zile. Loturile de control tratate cu placebo au fost irigate cu 500 ml de apă distilată sterilă. Toate tratamentele au fost efectuate în condiții de seră (25 ± 2°C, 75 ± 1% umiditate relativă și o fotoperioadă de 8 h lumină/16 h întuneric). Toate ghivecele au fost udate la fiecare două săptămâni și tratate lunar cu un îngrășământ NPK echilibrat (20-20-20, cu 3,6% sulf și microelemente TE; Zain Seeds, Egipt) la o concentrație de 3-4 g/l prin pulverizare foliară, conform recomandărilor pentru soiul specific și instrucțiunilor producătorului. Dacă nu se specifică altfel, frunzele mature complet expandate (a doua și a treia frunză de sus în sus) au fost colectate din fiecare replică biologică la 72 de ore după tratament (hpt), omogenizate, reunite și depozitate la -80 °C pentru analize ulterioare, inclusiv, dar fără a se limita la, localizarea histochimică in situ a indicatorilor de stres oxidativ, peroxidarea lipidică, antioxidanții enzimatici și non-enzimatici și expresia genelor.
Intensitatea infecției cu mucegai alb a fost evaluată săptămânal la 21 de zile după inoculare (dpi) folosind o scală de la 1 la 9 (Tabelul suplimentar S2) bazată pe scala Petzoldt și Dickson (1996) modificată de Teran și colab. (2006). Pe scurt, tulpinile și ramurile plantelor de fasole au fost examinate începând de la punctul de inoculare pentru a urmări progresia leziunilor de-a lungul internodurilor și nodurilor. Distanța leziunii de la punctul de inoculare până la cel mai îndepărtat punct de-a lungul tulpinii sau ramurii a fost apoi măsurată și i s-a atribuit un scor de la 1 la 9 pe baza localizării leziunii, unde (1) nu a indicat nicio infecție vizibilă în apropierea punctului de inoculare, iar (2-9) a indicat o creștere treptată a dimensiunii leziunii și progresia de-a lungul nodurilor/internodurilor (Tabelul suplimentar S2). Intensitatea infecției cu mucegai alb a fost apoi convertită în procente folosind formula 2:
În plus, aria de sub curba de progresie a bolii (AUDPC) a fost calculată folosind formula (Shaner și Finney, 1977), care a fost recent adaptată pentru putregaiul alb al fasolei comune (Chauhan et al., 2020) folosind ecuația 3:
Unde Yi = severitatea bolii la momentul ti, Yi+1 = severitatea bolii la următorul moment ti+1, ti = ora primei măsurători (în zile), ti+1 = ora următoarei măsurători (în zile), n = numărul total de puncte de timp sau puncte de observație. Parametrii de creștere a plantei de fasole, inclusiv înălțimea plantei (cm), numărul de ramuri per plantă și numărul de frunze per plantă, au fost înregistrați săptămânal timp de 21 de zile în toate replicările biologice.
În fiecare replică biologică, probele de frunze (a doua și a treia frunză complet dezvoltată de la vârf) au fost colectate în ziua 45 după tratament (la 15 zile după ultimul tratament). Fiecare replică biologică a constat din cinci ghivece (două plante per ghiveci). Aproximativ 500 mg de țesut zdrobit au fost utilizați pentru extracția pigmenților fotosintetici (clorofila a, clorofila b și carotenoizi) folosind 80% acetonă la 4 °C în întuneric. După 24 de ore, probele au fost centrifugate, iar supernatantul a fost colectat pentru determinarea colorimetrică a conținutului de clorofilă a, clorofilă b și carotenoizi folosind un spectrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia) conform metodei lui (Lichtenthaler, 1987) prin măsurarea absorbanței la trei lungimi de undă diferite (A470, A646 și A663 nm). În final, conținutul de pigmenți fotosintetici a fost calculat folosind următoarele formule 4-6 descrise de Lichtenthaler (1987).
La 72 de ore după tratament (hpt), frunzele (a doua și a treia frunză complet dezvoltată de la vârf) au fost colectate din fiecare replică biologică pentru localizarea histochimică in situ a peroxidului de hidrogen (H2O2) și a anionului superoxid (O2•−). Fiecare replică biologică a constat din cinci ghivece (două plante per ghiveci). Fiecare replică biologică a fost analizată în duplicat (două replici tehnice) pentru a asigura acuratețea, fiabilitatea și reproductibilitatea metodei. H2O2 și O2•− au fost determinate folosind 0,1% 3,3′-diaminobenzidină (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) sau respectiv nitroblue tetrazoliu (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), urmând metodele descrise de Romero-Puertas și colab. (2004) și Adam și colab. (1989) cu modificări minore. Pentru localizarea histochimică a H2O2 in situ, valvele au fost infiltrate în vid cu 0,1% DAB în tampon Tris 10 mM (pH 7,8) și apoi incubate la temperatura camerei la lumină timp de 60 de minute. Valvele au fost decolorate în TCA 0,15% (v/v) în etanol:cloroform 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egipt) și apoi expuse la lumină până când s-au înnegrit. În mod similar, valvele au fost infiltrate în vid cu 10 mM tampon fosfat de potasiu (pH 7,8) conținând 0,1% g/v HBT pentru localizarea histochimică a O2•− in situ. Valvele au fost incubate la lumină la temperatura camerei timp de 20 de minute, apoi decolorate conform instrucțiunilor de mai sus și apoi iluminate până la apariția unor pete albastru închis/violet. Intensitatea culorii maro (ca indicator H2O2) sau albastru-violet (ca indicator O2•−) rezultată a fost evaluată utilizând versiunea Fiji a pachetului de procesare a imaginilor ImageJ (http://fiji.sc; accesat la 7 martie 2024).
Malondialdehida (MDA; ca marker al peroxidării lipidice) a fost determinată conform metodei Du și Bramlage (1992) cu mici modificări. Frunzele din fiecare replică biologică (a doua și a treia frunză complet dezvoltată de la vârf) au fost colectate la 72 de ore după tratament (hpt). Fiecare replică biologică a inclus cinci ghivece (două plante per ghiveci). Fiecare replică biologică a fost analizată în duplicat (două replici tehnice) pentru a asigura acuratețea, fiabilitatea și reproductibilitatea metodei. Pe scurt, s-au utilizat 0,5 g de țesut foliar măcinat pentru extracția MDA cu 20% acid tricloracetic (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, SUA) conținând 0,01% hidroxitoluen butilat (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). Conținutul de MDA din supernatant a fost apoi determinat colorimetric prin măsurarea absorbanței la 532 și 600 nm utilizând un spectrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia) și apoi exprimat ca nmol g−1 FW.
Pentru evaluarea antioxidanților enzimatici și neenzimatici, frunzele (a doua și a treia frunză complet dezvoltată de sus în sus) au fost colectate din fiecare replică biologică la 72 de ore după tratament (hpt). Fiecare replică biologică a constat din cinci ghivece (două plante per ghiveci). Fiecare probă biologică a fost analizată în duplicat (două probe tehnice). Două frunze au fost măcinate cu azot lichid și utilizate direct pentru determinarea antioxidanților enzimatici și neenzimatici, a aminoacizilor totali, a conținutului de prolină, a expresiei genelor și a cuantificării oxalatului.
Fenolii totali solubili au fost determinați utilizând reactivul Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) cu mici modificări ale metodei descrise de Kahkonen și colab. (1999). Pe scurt, aproximativ 0,1 g de țesut foliar omogenizat a fost extras cu 20 ml metanol 80% la întuneric timp de 24 de ore, iar supernatantul a fost colectat după centrifugare. 0,1 ml din extractul probei a fost amestecat cu 0,5 ml reactiv Folin-Ciocalteu (10%), agitat timp de 30 de secunde și lăsat la întuneric timp de 5 minute. Apoi, 0,5 ml de soluție de carbonat de sodiu 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egipt) au fost adăugați în fiecare tub, amestecați bine și incubați la temperatura camerei la întuneric timp de 1 oră. După incubare, absorbanța amestecului de reacție a fost măsurată la 765 nm utilizând un spectrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia). Concentrația fenolilor totali solubili din extractele probei a fost determinată utilizând o curbă de calibrare a acidului galic (Fisher Scientific, Hampton, NH, SUA) și exprimată în miligrame de echivalent acid galic per gram de greutate proaspătă (mg GAE g-1 greutate proaspătă).
Conținutul total de flavonoide solubile a fost determinat conform metodei Djeridane și colab. (2006) cu mici modificări. Pe scurt, 0,3 ml din extractul metanolic de mai sus au fost amestecați cu 0,3 ml de soluție de clorură de aluminiu 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, SUA), agitați energic și apoi incubați la temperatura camerei timp de 5 minute, urmat de adăugarea a 0,3 ml de soluție de acetat de potasiu 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egipt), amestecați bine și incubați la temperatura camerei timp de 30 de minute la întuneric. După incubare, absorbanța amestecului de reacție a fost măsurată la 430 nm folosind un spectrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia). Concentrația de flavonoide solubile totale din extractele probei a fost determinată folosind o curbă de calibrare a rutinei (TCI America, Portland, OR, SUA) și apoi exprimată în miligrame de echivalent rutină per gram de greutate proaspătă (mg RE g-1 greutate proaspătă).
Conținutul total de aminoacizi liberi din frunzele de fasole a fost determinat utilizând un reactiv de ninhidrină modificat (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SUA) bazat pe metoda propusă de Yokoyama și Hiramatsu (2003) și modificată de Sun și colab. (2006). Pe scurt, 0,1 g de țesut măcinat au fost extrași cu tampon pH 5,4, iar 200 μL din supernatant au reacționat cu 200 μL de ninhidrină (2%) și 200 μL de piridină (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, SUA), incubați într-o baie de apă clocotită timp de 30 de minute, apoi răciți și măsurați la 580 nm utilizând un spectrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia). Pe de altă parte, prolina a fost determinată prin metoda Bates (Bates și colab., 1973). Prolina a fost extrasă cu acid sulfosalicilic 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SUA) și, după centrifugare, 0,5 ml de supernatant au fost amestecați cu 1 ml de acid acetic glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, SUA) și reactiv ninhidrină, incubați la 90°C timp de 45 de minute, răciți și măsurați la 520 nm folosind același spectrofotometru ca mai sus. Aminoacizii liberi totali și prolina din extractele de frunze au fost determinați folosind curbe de calibrare pentru glicină și prolină (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SUA), respectiv, și exprimați în mg/g greutate proaspătă.
Pentru a determina activitatea enzimatică a enzimelor antioxidante, aproximativ 500 mg de țesut omogenizat au fost extrași cu 3 ml de tampon Tris 50 mM (pH 7,8) conținând 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și 7,5% polivinilpirolidonă (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA), centrifugați la 10.000 × g timp de 20 de minute la frigider (4 °C), iar supernatantul (extract enzimatic brut) a fost colectat (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Catalaza (CAT) a reacționat apoi cu 2 ml de tampon fosfat de sodiu 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și 100 μl de soluție H2O2 269 mM pentru a-i determina activitatea enzimatică conform metodei Aebi (1984) cu mici modificări (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Activitatea enzimatică a peroxidazei dependente de guaiacol (POX) a fost determinată utilizând metoda Harrach et al. (2009). (2008) cu modificări minore (El-Nagar și colab., 2023; Osman și colab., 2023), iar activitatea enzimatică a polifenol oxidazei (PPO) a fost determinată după reacția cu 2,2 ml de tampon fosfat de sodiu 100 mM (pH 6,0), 100 μl de guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, SUA) și 100 μl de H2O2 12 mM. Metoda a fost ușor modificată față de (El-Nagar și colab., 2023; Osman și colab., 2023). Testul a fost efectuat după reacția cu 3 ml de soluție de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, SUA) (0,01 M) proaspăt preparată în tampon fosfat 0,1 M (pH 6,0). Activitatea CAT a fost măsurată prin monitorizarea descompunerii H2O2 la 240 nm (A240), activitatea POX a fost măsurată prin monitorizarea creșterii absorbanței la 436 nm (A436), iar activitatea PPO a fost măsurată prin înregistrarea fluctuațiilor de absorbanță la 495 nm (A495) la fiecare 30 s timp de 3 minute utilizând un spectrofotometru UV-160A (Shimadzu, Japonia).
RT-PCR în timp real a fost utilizată pentru a detecta nivelurile de transcriere a trei gene legate de antioxidanți, inclusiv catalaza peroxisomală (PvCAT1; nr. de acces GenBank KF033307.1), superoxid dismutaza (PvSOD; nr. de acces GenBank XM_068639556.1) și glutation reductază (PvGR; nr. de acces GenBank KY195009.1), în frunzele de fasole (a doua și a treia frunză complet dezvoltată de la vârf) la 72 de ore după ultimul tratament. Pe scurt, ARN-ul a fost izolat folosind kitul de extracție a ARN total Simply P (nr. cat. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China), conform protocolului producătorului. Apoi, ADNc-ul a fost sintetizat folosind kitul de sinteză a ADNc TOP script™, conform instrucțiunilor producătorului. Secvențele de primeri ale celor trei gene de mai sus sunt enumerate în tabelul suplimentar S3. PvActin-3 (număr de acces GenBank: XM_068616709.1) a fost utilizată ca genă de bază, iar expresia genică relativă a fost calculată folosind metoda 2-ΔΔCT (Livak și Schmittgen, 2001). Stabilitatea actinei în condiții de stres biotic (interacțiune incompatibilă între leguminoasele comune și ciuperca antracnotică Colletotrichum lindemuthianum) și stres abiotic (secetă, salinitate, temperatură scăzută) a fost demonstrată (Borges et al., 2012).
Inițial, am efectuat o analiză in silico la nivelul întregului genom a proteinelor oxaloacetat acetilhidrolază (OAH) din S. sclerotiorum utilizând instrumentul proteină-proteină BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Pe scurt, am folosit OAH de la Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxidă: 1191702; număr de acces GenBank XP_040799428.1; 342 aminoacizi) și Penicillium lagena (PlOAH; taxidă: 94218; număr de acces GenBank XP_056833920.1; 316 aminoacizi) ca secvențe de interogare pentru a mapa proteina omoloagă din S. sclerotiorum (taxidă: 5180). BLASTp a fost efectuat pe baza celor mai recente date disponibile despre genomul S. sclerotiorum în GenBank, pe site-ul Centrului Național pentru Informații Biotehnologice (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
În plus, gena OAH prezisă de la S. sclerotiorum (SsOAH) și analiza evolutivă și arborele filogenetic al AfOAH de la A. fijiensis CBS 313.89 și PlOAH de la P. lagena au fost deduse folosind metoda probabilității maxime în MEGA11 (Tamura et al., 2021) și modelul bazat pe matrice JTT (Jones et al., 1992). Arborele filogenetic a fost combinat cu analiza alinierii multiple a secvențelor proteice ale tuturor genelor OAH prezise (SsOAH) de la S. sclerotiorum și secvența de interogare folosind Instrumentul de aliniere bazat pe constrângeri (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos și Agarwala, 2007). În plus, cele mai potrivite secvențe de aminoacizi ale SsOAH de la S. sclerotiorum au fost aliniate cu secvențele de interogare (AfOAH și PlOAH) (Larkin et al., 2007) folosind ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), iar regiunile conservate din aliniere au fost vizualizate folosind instrumentul ESPript (versiunea 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
În plus, domeniile reprezentative funcționale prezise și situsurile conservate ale SsOAH de S. sclerotiorum au fost clasificate interactiv în diferite familii folosind instrumentul InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). În cele din urmă, modelarea tridimensională (3D) a structurii SsOAH de S. sclerotiorum prezise a fost efectuată folosind Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server versiunea 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) și validată folosind serverul SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Structurile tridimensionale prezise (format PDB) au fost vizualizate interactiv folosind pachetul UCSF-Chimera (versiunea 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen și colab., 2004).
PCR fluorescent cantitativ în timp real a fost utilizat pentru a determina nivelul transcripțional al oxaloacetat acetilhidrolazei (SsOAH; număr de acces GenBank: XM_001590428.1) în miceliile de Sclerotinia sclerotiorum. Pe scurt, S. sclerotiorum a fost inoculat într-un balon conținând PDB și plasat într-un incubator cu agitare (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SUA) la 25 ± 2 °C timp de 24 de ore la 150 rpm și în întuneric constant (24 de ore) pentru a stimula creșterea micelială. Ulterior, celulele au fost tratate cu L-ornitină și fungicidul Rizolex-T la concentrații finale de IC50 (aproximativ 40 și, respectiv, 3,2 mg/L) și apoi cultivate timp de încă 24 de ore în aceleași condiții. După incubare, culturile au fost centrifugate la 2500 rpm timp de 5 minute, iar supernatantul (miceliul fungic) a fost colectat pentru analiza expresiei genelor. În mod similar, miceliul fungic a fost colectat la 0, 24, 48, 72, 96 și 120 de ore după infecție de la plantele infectate care au format mucegai alb și miceliu bumbacos pe suprafața țesuturilor infectate. ARN-ul a fost extras din miceliul fungic și apoi ADNc a fost sintetizat așa cum s-a descris mai sus. Secvențele de primer pentru SsOAH sunt enumerate în Tabelul suplimentar S3. SsActin (număr de acces GenBank: XM_001589919.1) a fost utilizat ca genă de bază, iar expresia genică relativă a fost calculată folosind metoda 2-ΔΔCT (Livak și Schmittgen, 2001).
Acidul oxalic a fost determinat în bulion de dextroză de cartofi (PDB) și în probe de plante care conțin agentul patogen fungic Sclerotinia sclerotiorum conform metodei lui Xu și Zhang (2000) cu mici modificări. Pe scurt, izolatele de S. sclerotiorum au fost inoculate în flacoane care conțin PDB și apoi cultivate într-un incubator cu agitare (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, SUA) la 150 rpm la 25 ± 2 °C timp de 3-5 zile în întuneric constant (24 h) pentru a stimula creșterea miceliului. După incubare, cultura fungică a fost mai întâi filtrată printr-o hârtie de filtru Whatman #1 și apoi centrifugată la 2500 rpm timp de 5 minute pentru a îndepărta miceliul rezidual. Supernatantul a fost colectat și depozitat la 4°C pentru determinarea cantitativă ulterioară a oxalatului. Pentru prepararea probelor de plante, aproximativ 0,1 g de fragmente de țesut vegetal au fost extrase de trei ori cu apă distilată (2 ml de fiecare dată). Probele au fost apoi centrifugate la 2500 rpm timp de 5 minute, supernatantul a fost filtrat uscat printr-o hârtie de filtru Whatman nr. 1 și colectat pentru analize ulterioare.
Pentru analiza cantitativă a acidului oxalic, amestecul de reacție a fost preparat într-un tub cu dop de sticlă în următoarea ordine: 0,2 ml de probă (sau filtrat de cultură PDB sau soluție standard de acid oxalic), 0,11 ml de albastru de bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, SUA), 0,198 ml de acid sulfuric 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egipt) și 0,176 ml de dicromat de potasiu 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, SUA), iar apoi soluția a fost diluată la 4,8 ml cu apă distilată, amestecată energic și plasată imediat într-o baie de apă la 60 °C. După 10 minute, reacția a fost oprită prin adăugarea a 0,5 ml de soluție de hidroxid de sodiu (NaOH; 0,75 M). Absorbanța (A600) a amestecului de reacție a fost măsurată la 600 nm utilizând un spectrofotometru UV-160 (Shimadzu Corporation, Japonia). PDB și apa distilată au fost utilizate ca și controale pentru cuantificarea filtratelor de cultură, respectiv a probelor de plante. Concentrațiile de acid oxalic din filtratele de cultură, exprimate în micrograme de acid oxalic per mililitru de mediu PDB (μg.mL−1), și din extractele de frunze, exprimate în micrograme de acid oxalic per gram de greutate proaspătă (μg.g−1 FW), au fost determinate utilizând o curbă de calibrare a acidului oxalic (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, SUA).
Pe parcursul studiului, toate experimentele au fost concepute într-un design complet randomizat (CRD) cu șase replici biologice per tratament și cinci ghivece per replică biologică (două plante per ghiveci), cu excepția cazului în care se specifică altfel. Replicile biologice au fost analizate în duplicat (două replici tehnice). Replicile tehnice au fost utilizate pentru a verifica reproductibilitatea aceluiași experiment, dar nu au fost utilizate în analiza statistică pentru a evita replicile false. Datele au fost analizate statistic utilizând analiza varianței (ANOVA), urmată de testul Tukey-Kramer pentru diferențe semnificative (HSD) (p ≤ 0,05). Pentru experimentele in vitro, valorile IC50 și IC99 au fost calculate utilizând modelul probit și s-au calculat intervale de încredere de 95%.
Un total de patru izolate au fost colectate din diferite câmpuri de soia din Guvernoratul El Ghabiya, Egipt. Pe mediul PDA, toate izolatele au produs miceliu alb-crem care a devenit rapid alb-bumbacos (Figura 1A) și apoi bej sau maro în stadiul de scleroțiu. Scleroții sunt de obicei denși, negri, sferici sau neregulați, cu o lungime de 5,2 până la 7,7 mm și un diametru de 3,4 până la 5,3 mm (Figura 1B). Deși patru izolate au dezvoltat un model marginal de scleroți la marginea mediului de cultură după 10-12 zile de incubare la 25 ± 2 °C (Fig. 1A), numărul de scleroți per placă a fost semnificativ diferit între ele (P < 0,001), izolatul 3 având cel mai mare număr de scleroți (32,33 ± 1,53 scleroți per placă; Fig. 1C). În mod similar, izolatul nr. 3 a produs mai mult acid oxalic în PDB decât alte izolate (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Izolatul nr. 3 a prezentat caracteristici morfologice și microscopice tipice ale ciupercii fitopatogene Sclerotinia sclerotiorum. De exemplu, pe PDA, coloniile izolatului nr. 3 au crescut rapid, au fost alb-crem (Figura 1A), bej invers sau galben-maroniu deschis, somon, și au necesitat 6-7 zile la 25 ± 2°C pentru a acoperi complet suprafața unei plăci cu diametrul de 9 cm. Pe baza caracteristicilor morfologice și microscopice de mai sus, izolatul nr. 3 a fost identificat ca Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Caracteristicile și patogenitatea izolatelor de S. sclerotiorum din culturi comune de leguminoase. (A) Creșterea micelială a patru izolate de S. sclerotiorum pe mediu PDA, (B) scleroții a patru izolate de S. sclerotiorum, (C) numărul de scleroți (per placă), (D) secreția de acid oxalic pe mediu PDB (μg.mL−1) și (E) severitatea bolii (%) a patru izolate de S. sclerotiorum pe cultivarul de leguminoasă comercială susceptibilă Giza 3 în condiții de seră. Valorile reprezintă media ± deviația standard a cinci replicări biologice (n = 5). Litere diferite indică diferențe semnificative statistic între tratamente (p < 0,05). (F–H) Simptomele tipice ale mucegaiului alb au apărut pe tulpinile supraterane și respectiv pe siliciuri, la 10 zile după inocularea cu izolatul #3 (dpi). (I) Analiza evolutivă a regiunii spacerului transcris intern (ITS) a izolatului #3 de S. sclerotiorum a fost efectuată utilizând metoda probabilității maxime și comparată cu 20 de izolate/tulpini de referință obținute din baza de date a Centrului Național pentru Informații Biotehnologice (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Numerele de deasupra liniilor de grupare indică acoperirea regiunii (%), iar numerele de sub liniile de grupare indică lungimea ramificației.
În plus, pentru a confirma patogenitatea, patru izolate de S. sclerotiorum obținute au fost utilizate pentru a inocula cultivarul comercial de fasole Giza 3, sensibil, în condiții de seră, ceea ce este în concordanță cu postulatele lui Koch (Fig. 1E). Deși toate izolatele fungice obținute au fost patogene și au putut infecta fasolea verde (cv. Giza 3), provocând simptome tipice de mucegai alb pe toate părțile de deasupra solului (Fig. 1F), în special pe tulpini (Fig. 1G) și păstăi (Fig. 1H) la 10 zile după inoculare (dpi), izolatul 3 a fost cel mai agresiv izolat în două experimente independente. Izolatul 3 a avut cea mai mare severitate a bolii (%) la plantele de fasole (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 și 76,7 ± 3,1 la 7, 14 și respectiv 21 de zile după infectare; Figura 1F).
Identificarea celui mai invaziv izolat de S. sclerotiorum, numărul 3, a fost confirmată în continuare pe baza secvențierii cu spacer transcris intern (ITS) (Fig. 1I). Analiza filogenetică dintre izolatul nr. 3 și 20 de izolate/tulpini de referință a arătat o similaritate ridicată (>99%) între ele. Este de remarcat faptul că izolatul nr. 3 de S. sclerotiorum (533 pb) are o similaritate ridicată cu izolatul american LPM36 de S. sclerotiorum izolat din semințe uscate de mazăre (număr de acces GenBank MK896659.1; 540 pb) și cu izolatul chinezesc YKY211 de S. sclerotiorum (număr de acces GenBank OR206374.1; 548 pb), care provoacă putrezirea tulpinii la Matthiola incana, toate acestea fiind grupate separat în partea de sus a dendrogramei (Figura 1I). Noua secvență a fost depusă în baza de date NCBI și denumită „Sclerotinia sclerotiorum – izolat YN-25” (număr de acces GenBank PV202792). Se poate observa că izolatul 3 este cel mai invaziv; prin urmare, acest izolat a fost ales pentru studiu în toate experimentele ulterioare.
Activitatea antibacteriană a diaminei L-ornitine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) la diferite concentrații (12,5, 25, 50, 75, 100 și 125 mg/L) împotriva izolatului 3 de S. sclerotiorum a fost investigată in vitro. Este de remarcat faptul că L-ornitina a exercitat un efect antibacterian și a inhibat treptat creșterea radială a hifelor de S. sclerotiorum într-un mod dependent de doză (Figura 2A, B). La cea mai mare concentrație testată (125 mg/L), L-ornitina a demonstrat cea mai mare rată de inhibare a creșterii miceliale (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), care a fost echivalentă cu fungicidul comercial Rizolex-T (rata de inhibare 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) la cea mai mare concentrație testată (10 mg/L), indicând o eficacitate similară.
Figura 2. Activitatea antibacteriană in vitro a L-ornitinei împotriva Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparație a activității antibacteriene a diferitelor concentrații de L-ornitină împotriva S. sclerotiorum cu fungicidul comercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Rata de inhibare (%) a creșterii miceliale a S. sclerotiorum după tratamentul cu diferite concentrații de L-ornitină (12,5, 25, 50, 75, 100 și 125 mg/L) sau Rizolex-T (2, 4, 6, 8 și 10 mg/L), respectiv. Valorile reprezintă media ± deviația standard a cinci replici biologice (n = 5). Litere diferite indică diferențele statistice dintre tratamente (p < 0,05). (D, E) Analiza de regresie a modelului Probit a L-ornitinei și respectiv a fungicidului comercial Rizolex-T. Linia de regresie a modelului probit este reprezentată de o linie albastră continuă, iar intervalul de încredere (95%) este reprezentat de o linie roșie punctată.
În plus, a fost efectuată o analiză de regresie probit, iar graficele corespunzătoare sunt prezentate în Tabelul 1 și Figurile 2D și E. Pe scurt, valoarea acceptabilă a pantei (y = 2,92x − 4,67) și statisticile semnificative asociate (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 și p < 0,0001; Figura 2D) ale L-ornitinei au indicat o activitate antifungică sporită împotriva S. sclerotiorum în comparație cu fungicidul comercial Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 și p < 0,0001) (Tabelul 1).
Tabelul 1. Valorile concentrației inhibitorii semi-maxime (IC50) și IC99 (mg/l) ale L-ornitinei și fungicidului comercial „Rizolex-T” împotriva S. sclerotiorum.
În general, L-ornitina (250 mg/L) a redus semnificativ dezvoltarea și severitatea mucegaiului alb la plantele de fasole comună tratate, comparativ cu plantele infectate cu S. sclerotiorum netratate (control; Figura 3A). Pe scurt, deși severitatea bolii la plantele de control infectate netratate a crescut treptat (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 și 92,33 ± 3,06%), L-ornitina a redus semnificativ severitatea bolii (%) pe parcursul experimentului (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 și 26,36 ± 3,07) la 7, 14 și, respectiv, 21 de zile după tratament (dpt) (Figura 3A). În mod similar, când plantele de fasole infectate cu S. sclerotiorum au fost tratate cu 250 mg/L L-ornitină, aria de sub curba de progresie a bolii (AUDPC) a scăzut de la 1274,33 ± 33,13 în lotul de control netratat la 281,03 ± 7,95, ceea ce a fost ușor mai mic decât cel al fungicidului Rizolex-T de 50 mg/L ca martor pozitiv (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Aceeași tendință a fost observată și în cel de-al doilea experiment.
Fig. 3. Efectul aplicării exogene a L-ornitinei asupra dezvoltării putregaiului alb la fasolea comună cauzat de Sclerotinia sclerotiorum în condiții de seră. (A) Curba de progresie a bolii la mucegaiul alb la fasolea comună după tratamentul cu 250 mg/L L-ornitină. (B) Aria de sub curba de progresie a bolii (AUDPC) la mucegaiul alb la fasolea comună după tratamentul cu L-ornitină. Valorile reprezintă media ± deviația standard a cinci replici biologice (n = 5). Litere diferite indică diferențe semnificative statistic între tratamente (p < 0,05).
Aplicarea exogenă a 250 mg/L L-ornitină a crescut treptat înălțimea plantei (Fig. 4A), numărul de ramuri pe plantă (Fig. 4B) și numărul de frunze pe plantă (Fig. 4C) după 42 de zile. În timp ce fungicidul comercial Rizolex-T (50 mg/L) a avut cel mai mare efect asupra tuturor parametrilor nutriționali studiați, aplicarea exogenă a 250 mg/L L-ornitină a avut al doilea cel mai mare efect în comparație cu loturile de control netratate (Fig. 4A-C). Pe de altă parte, tratamentul cu L-ornitină nu a avut un efect semnificativ asupra conținutului de pigmenți fotosintetici clorofilă a (Fig. 4D) și clorofilă b (Fig. 4E), dar a crescut ușor conținutul total de carotenoizi (0,56 ± 0,03 mg/g greutate naturală) comparativ cu controlul negativ (0,44 ± 0,02 mg/g greutate naturală) și controlul pozitiv (0,46 ± 0,02 mg/g greutate naturală; Fig. 4F). Per total, aceste rezultate indică faptul că L-ornitina nu este fitotoxică pentru leguminoasele tratate și poate chiar stimula creșterea acestora.
Fig. 4. Efectul aplicării de L-ornitină exogenă asupra caracteristicilor de creștere și pigmenților fotosintetici ai frunzelor de fasole infectate cu Sclerotinia sclerotiorum în condiții de seră. (A) Înălțimea plantei (cm), (B) Număr de ramuri pe plantă, (C) Număr de frunze pe plantă, (D) Conținut de clorofilă a (mg g-1 fr wt), (E) Conținut de clorofilă b (mg g-1 fr wt), (F) Conținut total de carotenoizi (mg g-1 fr wt). Valorile reprezintă media ± deviația standard a cinci replicări biologice (n = 5). Litere diferite indică diferențe semnificative statistic între tratamente (p < 0,05).
Localizarea histochimică in situ a speciilor reactive de oxigen (ROS; exprimate ca peroxid de hidrogen [H2O2]) și a radicalilor liberi (exprimați ca anioni superoxid [O2•−]) a relevat că aplicarea exogenă de L-ornitină (250 mg/L) a redus semnificativ acumularea de H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) și O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) comparativ cu acumularea atât a plantelor infectate netratate (173,31 ± 12,06 și 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respectiv) cât și a plantelor tratate cu 50 mg/L de fungicid comercial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 și 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectiv) la 72 h. Niveluri ridicate de H2O2 și O2•− s-au acumulat sub hpt (Fig. 5A, B). În mod similar, testul de malondialdehidă (MDA) pe bază de TCA a arătat că plantele de fasole infectate cu S. sclerotiorum au acumulat niveluri mai ridicate de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) în frunzele lor (Fig. 5C). Cu toate acestea, aplicarea exogenă de L-ornitină a redus semnificativ peroxidarea lipidică, după cum reiese din scăderea conținutului de MDA la plantele tratate (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Efectul aplicării L-ornitinei exogene asupra principalilor markeri ai stresului oxidativ și ai mecanismelor de apărare antioxidantă non-enzimatică în frunzele de fasole infectate cu S. sclerotiorum la 72 de ore după infectare în condiții de seră. (A) Peroxid de hidrogen (H2O2; nmol g−1 FW) la 72 hpt, (B) anion superoxid (O2•−; nmol g−1 FW) la 72 hpt, (C) malondialdehidă (MDA; nmol g−1 FW) la 72 hpt, (D) fenoli solubili totali (mg GAE g−1 FW) la 72 hpt, (E) flavonoide solubile totale (mg RE g−1 FW) la 72 hpt, (F) aminoacizi liberi totali (mg g−1 FW) la 72 hpt și (G) conținut de prolină (mg g−1 FW) la 72 hpt. Valorile reprezintă media ± deviația standard (media ± SD) a 5 replici biologice (n = 5). Litere diferite indică diferențe semnificative statistic între tratamente (p < 0,05).