Am raportat anterior că nivelurile serice ale metabolitului triptofan derivat din intestin, acidul indol-3-propionic (IPA), sunt mai scăzute la pacienții cu fibroză hepatică. În acest studiu, am investigat transcriptomul și metilomul ADN-ului în ficatul obez în raport cu nivelurile serice de IPA, precum și rolul IPA în inducerea inactivării fenotipice a celulelor stelate hepatice (HSC) in vitro.
Studiul a inclus 116 pacienți obezi fără diabet zaharat de tip 2 (DZT2) (vârsta 46,8 ± 9,3 ani; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m²) care au fost supuși unei intervenții chirurgicale bariatrice la Centrul de Chirurgie Bariatrică Kuopio (KOBS). Nivelurile circulante de IPA au fost măsurate prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS), analiza transcriptomului hepatic a fost efectuată prin secvențiere totală a ARN-ului, iar analiza metilării ADN-ului a fost efectuată utilizând Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Celule stelate hepatice umane (LX-2) au fost utilizate pentru experimentele in vitro.
Nivelurile serice de IPA au fost corelate cu expresia genelor implicate în căile apoptotice, mitofagice și de longevitate din ficat. Gena AKT serină/treonin kinaza 1 (AKT1) a fost gena interactivă cea mai abundentă și dominantă în transcrierea hepatică și în profilurile de metilare a ADN-ului. Tratamentul cu IPA a indus apoptoza, a scăzut respirația mitocondrială și a modificat morfologia celulară și dinamica mitocondrială prin modularea expresiei genelor cunoscute pentru reglarea fibrozei, apoptozei și supraviețuirii celulelor LX-2.
Luate împreună, aceste date susțin faptul că IPA are potențiale efecte terapeutice și poate induce apoptoza și schimba fenotipul HSC către o stare inactivă, extinzând astfel posibilitatea inhibării fibrozei hepatice prin interferarea cu activarea HSC și metabolismul mitocondrial.
Prevalența obezității și a sindromului metabolic a fost asociată cu o incidență crescândă a steatozei steatoze asociate metabolic (MASLD); boala afectează 25% până la 30% din populația generală [1]. Principala consecință a etiologiei MASLD este fibroza hepatică, un proces dinamic caracterizat prin acumularea continuă de matrice extracelulară fibroasă (MEC) [2]. Principalele celule implicate în fibroza hepatică sunt celulele stelate hepatice (HSC), care prezintă patru fenotipuri cunoscute: latente, activate, inactivate și senescente [3, 4]. HSC-urile pot fi activate și se pot transdiferenția dintr-o formă latentă în celule proliferative asemănătoare fibroblastelor cu cerințe energetice ridicate, cu expresie crescută a α-actinei musculare netede (α-SMA) și a colagenului de tip I (Col-I) [5, 6]. În timpul inversării fibrozei hepatice, HSC-urile activate sunt eliminate prin apoptoză sau inactivare. Aceste procese includ reglarea negativă a genelor fibrogene și modularea genelor prosupraviețuire (cum ar fi căile de semnalizare NF-κB și PI3K/Akt) [7, 8], precum și modificări ale dinamicii și funcției mitocondriale [9].
Nivelurile serice ale metabolitului triptofanului, acidul indol-3-propionic (IPA), produs în intestin, s-au dovedit a fi scăzute în bolile metabolice umane, inclusiv MASLD [10–13]. IPA este asociat cu aportul de fibre alimentare, este cunoscut pentru efectele sale antioxidante și antiinflamatorii și atenuează fenotipul steatohepatitei non-alcoolice (NASH) indus de dietă in vivo și in vitro [11–14]. Unele dovezi provin din studiul nostru anterior, care a demonstrat că nivelurile serice de IPA au fost mai mici la pacienții cu fibroză hepatică decât la pacienții obezi fără fibroză hepatică în Studiul Kuopio privind Chirurgia Bariatrică (KOBS). În plus, am arătat că tratamentul cu IPA ar putea reduce expresia genelor care sunt markeri clasici ai aderenței celulare, migrării celulare și activării celulelor stem hematopoietice într-un model de celule stelate hepatice umane (LX-2) și este un potențial metabolit hepatoprotector [15]. Cu toate acestea, rămâne neclar cum induce IPA regresia fibrozei hepatice prin activarea apoptozei HSC și a bioenergeticii mitocondriale.
Aici, demonstrăm că IPA seric este asociat cu exprimarea genelor îmbogățite în căile de apoptoză, mitofagie și longevitate în ficatul persoanelor obeze, dar fără diabet zaharat de tip 2 (KOBS). În plus, am descoperit că IPA poate induce eliminarea și degradarea celulelor stem hematopoietice activate (HSC) prin intermediul căii de inactivare. Aceste rezultate dezvăluie un rol nou pentru IPA, făcându-l o potențială țintă terapeutică pentru promovarea regresiei fibrozei hepatice.
Un studiu anterior din cohorta KOBS a arătat că pacienții cu fibroză hepatică au avut niveluri circulante de IPA mai scăzute comparativ cu pacienții fără fibroză hepatică [15]. Pentru a exclude potențialul efect de confuzie al diabetului de tip 2, am recrutat 116 pacienți obezi fără diabet de tip 2 (vârsta medie ± DS: 46,8 ± 9,3 ani; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabelul 1) din studiul KOBS în curs de desfășurare, ca populație de studiu [16]. Toți participanții și-au dat consimțământul informat în scris, iar protocolul studiului a fost aprobat de Comitetul de Etică al Spitalului Județean Savo de Nord, în conformitate cu Declarația de la Helsinki (54/2005, 104/2008 și 27/2010).
Specimenele de biopsie hepatică au fost obținute în timpul intervențiilor chirurgicale bariatrice și evaluate histologic de către patologi cu experiență, conform criteriilor descrise anterior [17, 18]. Criteriile de evaluare sunt rezumate în Tabelul suplimentar S1 și au fost descrise anterior [19].
Probele de ser à jeun au fost analizate prin cromatografie lichidă nețintită-spectrometrie de masă (LC-MS) pentru analiza metabolomică (n = 116). Probele au fost analizate utilizând un sistem UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germania) așa cum s-a descris anterior19. Identificarea alcoolului izopropilic (IPA) s-a bazat pe timpul de retenție și compararea spectrului MS/MS cu standarde pure. Intensitatea semnalului IPA (aria vârfului) a fost luată în considerare în toate analizele ulterioare [20].
Secvențierea ARN-ului hepatic complet a fost efectuată utilizând Illumina HiSeq 2500, iar datele au fost preprocesate așa cum s-a descris anterior [19, 21, 22]. Am efectuat o analiză diferențială țintită a expresiei transcrierilor care afectează funcția/biogeneza mitocondrială utilizând 1957 de gene selectate din baza de date MitoMiner 4.0 [23]. Analiza metilării ADN-ului hepatic a fost efectuată utilizând Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, SUA) folosind aceeași metodologie descrisă anterior [24, 25].
Celulele stelate hepatice umane (LX-2) au fost furnizate cu amabilitate de către Prof. Stefano Romeo și au fost cultivate și menținute în mediu DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Pentru a selecta doza de lucru de IPA, celulele LX-2 au fost tratate cu diferite concentrații de IPA (10 μM, 100 μM și 1 mM; Sigma, 220027) în mediu DMEM/F12 timp de 24 de ore. În plus, pentru a investiga capacitatea IPA de a inactiva HSC-urile, celulele LX-2 au fost co-tratate cu 5 ng/ml TGF-β1 (sisteme R&D, 240-B-002/CF) și 1 mM IPA în mediu fără ser timp de 24 de ore. Pentru controalele vehiculului corespunzătoare, s-a utilizat HCL 4 nM conținând 0,1% BSA pentru tratamentul cu TGF-β1 și s-a utilizat 0,05% DMSO pentru tratamentul cu IPA, ambele fiind utilizate împreună pentru tratamentul combinat.
Apoptoza a fost evaluată utilizând kitul FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit cu 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, SUA, Cat# 640922), conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, LX-2 (1 × 105 celule/godeu) au fost cultivate peste noapte în plăci cu 12 godeuri și apoi tratate cu doze multiple de IPA sau IPA și TGF-β1. În ziua următoare, celulele flotante și aderente au fost colectate, tripsinizate, spălate cu PBS, resuspendate în tampon de legare a Annexin V și incubate cu FITC-Annexin V și 7-AAD timp de 15 minute.
Mitocondriile din celulele vii au fost colorate pentru activitatea oxidativă utilizând Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Pentru testele MTR, celulele LX-2 au fost incubate la densități egale cu IPA și TGF-β1. După 24 de ore, celulele vii au fost tripsinizate, spălate cu PBS și apoi incubate cu 100 μM MTR în mediu fără ser la 37 °C timp de 20 de minute, așa cum s-a descris anterior [26]. Pentru analiza morfologiei celulelor vii, dimensiunea celulelor și complexitatea citoplasmatică au fost analizate utilizând parametrii de împrăștiere directă (FSC) și, respectiv, de împrăștiere laterală (SSC).
Toate datele (30.000 de evenimente) au fost obținute folosind NovoCyte Quanteon (Agilent) și analizate folosind software-ul NovoExpress® 1.4.1 sau FlowJo V.10.
Rata consumului de oxigen (OCR) și rata de acidificare extracelulară (ECAR) au fost măsurate în timp real utilizând un analizor de flux extracelular Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) echipat cu un Seahorse XF Cell Mito Stress, conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 2 × 104 celule LX-2/godeu au fost însămânțate pe plăci de cultură celulară XF96. După incubarea peste noapte, celulele au fost tratate cu izopropanol (IPA) și TGF-β1 (Metode suplimentare 1). Analiza datelor a fost efectuată utilizând software-ul Seahorse XF Wave, care include generatorul de rapoarte de testare a fenotipului energiei celulare Seahorse XF. Pe baza acestuia, a fost calculat un indice de sănătate bioenergetică (BHI) [27].
ARN-ul total a fost transcris în ADNc. Pentru metode specifice, consultați referința [15]. Nivelurile de ARNm ale proteinei acide ribozomale P0 (RPLP0) umane 60S și ale ciclofilinei A1 (PPIA) au fost utilizate ca și controale genetice constitutive. Sistemul PCR în timp real QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Olanda) a fost utilizat cu kitul TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) sau cu kitul Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), iar multiplicarea relativă a expresiei genelor a fost calculată utilizând parametrii comparativi de ciclism ai valorii Ct (ΔΔCt) și metoda ∆∆Ct. Detalii despre primeri sunt furnizate în tabelele suplimentare S2 și S3.
ADN-ul nuclear (ADNnc) și ADN-ul mitocondrial (ADNmt) au fost extrase folosind kitul DNeasy pentru sânge și țesuturi (Qiagen), așa cum s-a descris anterior [28]. Cantitatea relativă de ADNmt a fost calculată prin calcularea raportului dintre fiecare regiune țintă a ADNmt și media geometrică a celor trei regiuni de ADN nuclear (ADNmt/ADNnc), așa cum este detaliat în Metodele suplimentare 2. Detalii despre primerii pentru ADNmt și ADNnc sunt furnizate în Tabelul suplimentar S4.
Celulele vii au fost colorate cu Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) pentru a vizualiza rețelele mitocondriale intercelulare și intracelulare. Celulele LX-2 (1 × 104 celule/godeu) au fost cultivate pe lame de sticlă în plăci de cultură cu fund de sticlă corespunzătoare (Ibidi GmbH, Martinsried, Germania). După 24 de ore, celulele LX-2 vii au fost incubate cu 100 μM MTR timp de 20 de minute la 37 °C, iar nucleii celulari au fost colorați cu DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) așa cum s-a descris anterior [29]. Rețelele mitocondriale au fost vizualizate utilizând un microscop inversat Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germania) echipat cu un modul confocal Zeiss LSM 800 la 37 °C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2 utilizând un obiectiv 63×NA 1.3. Am achiziționat zece imagini din seria Z pentru fiecare tip de probă. Fiecare serie Z conține 30 de secțiuni, fiecare cu o grosime de 9,86 μm. Pentru fiecare probă, au fost achiziționate imagini din zece câmpuri vizuale diferite folosind software-ul ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germania), iar analiza morfologiei mitocondriale a fost efectuată folosind software-ul ImageJ (v1.54d) [30, 31] conform parametrilor detaliați în Metodele suplimentare 3.
Celulele au fost fixate cu glutaraldehidă 2% în tampon fosfat 0,1 M, urmată de fixare cu soluție de tetroxid de osmiu 1% (Sigma Aldrich, MO, SUA), deshidratate treptat cu acetonă (Merck, Darmstadt, Germania) și în final încorporate în rășină epoxidică. Secțiunile ultrasubțiri au fost preparate și colorate cu acetat de uranil 1% (Merck, Darmstadt, Germania) și citrat de plumb 1% (Merck, Darmstadt, Germania). Imaginile ultrastructurale au fost obținute utilizând un microscop electronic cu transmisie JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japonia) la o tensiune de accelerare de 80 kV.
Morfologia celulelor LX-2 tratate cu IPA timp de 24 de ore a fost analizată prin microscopie cu contrast de fază la o mărire de 50x, utilizând un microscop cu lumină inversată Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 și AxioCam MRm, Jena, Germania).
Datele clinice au fost exprimate ca medie ± deviație standard sau mediană (interval intercuartil: IQR). Pentru a compara diferențele dintre cele trei grupuri de studiu s-au utilizat analiza varianței într-o singură direcție (variabile continue) sau testul χ² (variabile categorice). Rata fals pozitivă (FDR) a fost utilizată pentru a corecta testele multiple, iar genele cu FDR < 0,05 au fost considerate semnificative statistic. Analiza de corelație Spearman a fost utilizată pentru a corela metilarea ADN-ului CpG cu intensitatea semnalului IPA, cu valori p nominale (p < 0,05) raportate.
Analiza căilor de transmitere a fost efectuată utilizând un instrument web de analiză a setului de gene (WebGestalt) pentru 268 de transcrieri (p nominal < 0,01), 119 transcrieri asociate mitocondriilor (p nominal < 0,05) și 4350 de CpG din 3093 de transcrieri hepatice care au fost asociate cu nivelurile serice circulante de IPA. Instrumentul Venny DB (versiunea 2.1.0), disponibil gratuit, a fost utilizat pentru a găsi gene care se suprapun, iar StringDB (versiunea 11.5) a fost utilizat pentru a vizualiza interacțiunile proteină-proteină.
Pentru experimentul LX-2, probele au fost testate pentru normalitate folosind testul D'Agostino-Pearson. Datele au fost obținute din cel puțin trei replici biologice și supuse ANOVA unidirecțională cu testul Bonferroni post hoc. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă statistic. Datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard, iar numărul de experimente este indicat în fiecare figură. Toate analizele și graficele au fost efectuate folosind software-ul statistic GraphPad Prism 8 pentru Windows (GraphPad Software Inc., versiunea 8.4.3, San Diego, SUA).
Mai întâi, am investigat asocierea nivelurilor serice de IPA cu transcrierile hepatice, ale întregului corp și mitocondriale. În profilul total al transcrierilor, cea mai puternică genă asociată cu nivelurile serice de IPA a fost MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; protein kinaza activată de mitogen 3); în profilul transcrierilor legate de mitocondrii, cea mai puternică genă asociată a fost AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serină/treonină kinază 1) (Fișier suplimentar 1 și Fișier suplimentar 2).
Apoi am analizat transcrierile globale (n = 268; p < 0,01) și transcrierile asociate mitocondriilor (n = 119; p < 0,05), identificând în cele din urmă apoptoza ca fiind cea mai semnificativă cale canonică (p = 0,0089). Pentru transcrierile mitocondriale asociate cu nivelurile serice de IPA, ne-am concentrat pe apoptoză (FDR = 0,00001), mitofagie (FDR = 0,00029) și căile de semnalizare TNF (FDR = 0,000006) (Figura 1A, Tabelul 2 și Figurile suplimentare 1A-B).
Analiza suprapusă a transcrierilor globale, asociate mitocondriilor și a metilării ADN-ului în ficatul uman în asociere cu nivelurile serice de IPA. A reprezintă 268 de transcrieri globale, 119 transcrieri asociate mitocondriilor și transcrieri ADN metilate care sunt mapate la 3092 de situsuri CpG asociate cu nivelurile serice de IPA (valori p < 0,01 pentru transcrieri globale și ADN metilat și valori p < 0,05 pentru transcrieri mitocondriale). Transcrierile majore care se suprapun sunt prezentate în mijloc (AKT1 și YKT6). B Harta de interacțiune a celor 13 gene cu cel mai mare scor de interacțiune (0,900) cu alte gene a fost construită din cele 56 de gene care se suprapun (regiunea liniei negre) care au fost semnificativ asociate cu nivelurile serice de IPA folosind instrumentul online StringDB. Verde: Gene mapate la componenta celulară Gene Ontology (GO): mitocondrii (GO:0005739). AKT1 este proteina cu cel mai mare scor (0,900) pentru interacțiunile cu alte proteine ​​pe baza datelor (bazate pe text mining, experimente, baze de date și co-exprimare). Nodurile rețelei reprezintă proteine, iar muchiile reprezintă conexiunile dintre proteine.
Întrucât metaboliții microbiotei intestinale pot regla compoziția epigenetică prin metilarea ADN-ului [32], am investigat dacă nivelurile serice de IPA au fost asociate cu metilarea ADN-ului hepatic. Am descoperit că cele două situsuri majore de metilare asociate cu nivelurile serice de IPA au fost în apropierea regiunii 3 bogate în prolină-serină (C19orf55) și a membrului 6 (mic) al familiei de proteine ​​de șoc termic (HSPB6) (fișier suplimentar 3). Metilarea ADN-ului 4350 CpG (p < 0,01) a fost corelată cu nivelurile serice de IPA și a fost îmbogățită în căile de reglare a longevității (p = 0,006) (Figura 1A, Tabelul 2 și Figura suplimentară 1C).
Pentru a înțelege mecanismele biologice care stau la baza asocierilor dintre nivelurile serice de IPA, transcrierile globale, transcrierile asociate mitocondriilor și metilarea ADN-ului în ficatul uman, am efectuat o analiză de suprapunere a genelor identificate în analiza anterioară a căilor (Figura 1A). Rezultatele analizei de îmbogățire a căilor pentru cele 56 de gene suprapuse (în interiorul liniei negre din Figura 1A) au arătat că calea apoptozei (p = 0,00029) a evidențiat două gene comune celor trei analize: AKT1 și YKT6 (omologul YKT6 v-SNARE), așa cum se arată în diagrama Venn (Figura suplimentară 2 și Figura 1A). Interesant este că am descoperit că AKT1 (cg19831386) și YKT6 (cg24161647) au fost corelate pozitiv cu nivelurile serice de IPA (fișier suplimentar 3). Pentru a identifica potențialele interacțiuni proteice dintre produsele genetice, am selectat 13 gene cu cel mai mare scor comun al regiunii (0,900) dintre cele 56 de gene suprapuse ca date de intrare și am construit o hartă a interacțiunii. Conform nivelului de încredere (încredere marginală), gena AKT1 cu cel mai mare scor (0,900) s-a aflat în vârf (Figura 1B).
Pe baza analizei căii de metabolizare, am constatat că apoptoza a fost principala cale de metabolizare, așa că am investigat dacă tratamentul cu IPA ar afecta apoptoza HSC-urilor in vitro. Anterior, am demonstrat că diferite doze de IPA (10 μM, 100 μM și 1 mM) au fost netoxice pentru celulele LX-2 [15]. Acest studiu a arătat că tratamentul cu IPA la 10 μM și 100 μM a crescut numărul de celule viabile și necrotice. Cu toate acestea, comparativ cu grupul de control, viabilitatea celulară a scăzut la o concentrație de IPA de 1 mM, în timp ce rata de necroză celulară a rămas neschimbată (Figura 2A, B). În continuare, pentru a găsi concentrația optimă pentru a induce apoptoza în celulele LX-2, am testat IPA de 10 μM, 100 μM și 1 mM timp de 24 de ore (Figura 2A-E și Figura suplimentară 3A-B). Interesant este că IPA 10 μM și 100 μM a scăzut rata apoptozei (%), însă IPA 1 mM a crescut apoptoza tardivă și rata apoptozei (%) în comparație cu grupul de control și, prin urmare, a fost ales pentru experimente ulterioare (Figurile 2A-D).
IPA induce apoptoza celulelor LX-2. Metoda de dublă colorare cu Anexină V și 7-AAD a fost utilizată pentru a cuantifica rata apoptotică și morfologia celulară prin citometrie în flux. Celulele BA au fost incubate cu 10 μM, 100 μM și 1 mM IPA timp de 24 de ore sau cu F–H TGF-β1 (5 ng/ml) și 1 mM IPA în mediu fără ser timp de 24 de ore. A: celule vii (Annexin V -/ 7AAD-); B: celule necrotice (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: timpuriu (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: tardiv (Annexin V+/7AAD.+); E, H: procentul total de celule apoptotice timpurii și tardive în rată apoptotică (%). Datele sunt exprimate ca medie ± SD, n = 3 experimente independente. Comparațiile statistice au fost efectuate utilizând ANOVA cu o singură direcție cu testul Bonferroni post hoc. *p < 0,05; ****p < 0,0001
După cum am arătat anterior, 5 ng/ml TGF-β1 poate induce activarea HSC prin creșterea expresiei genelor marker clasice [15]. Celulele LX-2 au fost tratate cu 5 ng/ml TGF-β1 și 1 mM IPA în combinație (Fig. 2E–H). Tratamentul cu TGF-β1 nu a modificat rata apoptozei, cu toate acestea, co-tratamentul cu IPA a crescut apoptoza tardivă și rata apoptozei (%) în comparație cu tratamentul cu TGF-β1 (Fig. 2E–H). Aceste rezultate indică faptul că 1 mM IPA poate promova apoptoza în celulele LX-2 independent de inducerea TGF-β1.
Am investigat în continuare efectul IPA asupra respirației mitocondriale în celulele LX-2. Rezultatele au arătat că 1 mM IPA a redus parametrii ratei de consum de oxigen (OCR): respirația non-mitocondrială, respirația bazală și maximă, scurgerea de protoni și producția de ATP în comparație cu grupul de control (Figura 3A, B), în timp ce indicele de sănătate bioenergetică (BHI) nu s-a modificat.
IPA reduce respirația mitocondrială în celulele LX-2. Curba respirației mitocondriale (OCR) este prezentată ca parametri ai respirației mitocondriale (respirație non-mitocondrială, respirație bazală, respirație maximă, scurgere de protoni, generare de ATP, SRC și BHI). Celulele A și B au fost incubate cu 10 μM, 100 μM și 1 mM IPA timp de 24 de ore, respectiv. Celulele C și D au fost incubate cu TGF-β1 (5 ng/ml) și 1 mM IPA în mediu fără ser timp de 24 de ore, respectiv. Toate măsurătorile au fost normalizate în funcție de conținutul de ADN utilizând kitul CyQuant. BHI: indice de sănătate bioenergetică; SRC: capacitate de rezervă respiratorie; OCR: rată de consum de oxigen. Datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard (SD), n = 5 experimente independente. Comparațiile statistice au fost efectuate utilizând ANOVA cu o singură direcție și testul Bonferroni post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; și ***p < 0,001
Pentru a obține o înțelegere mai cuprinzătoare a efectului IPA asupra profilului bioenergetic al celulelor LX-2 activate de TGF-β1, am analizat fosforilarea oxidativă mitocondrială prin OCR (Fig. 3C, D). Rezultatele au arătat că tratamentul cu TGF-β1 a putut reduce respirația maximă, capacitatea de rezervă respiratorie (SRC) și BHI în comparație cu grupul de control (Fig. 3C, D). În plus, tratamentul combinat a scăzut respirația bazală, scurgerea de protoni și producția de ATP, dar SRC și BHI au fost semnificativ mai mari decât cele tratate cu TGF-β1 (Fig. 3C, D).
De asemenea, am efectuat „Testul Fenotipului Energiei Celulare” furnizat de software-ul Seahorse (Fig. suplimentară 4A-D). După cum se arată în Fig. suplimentară 3B, atât potențialul metabolic OCR, cât și cel ECAR au scăzut după tratamentul cu TGF-β1, cu toate acestea, nu s-a observat nicio diferență în grupurile de tratament combinat și IPA comparativ cu grupul de control. În plus, atât nivelurile bazale, cât și cele de stres ale OCR au scăzut după tratamentul combinat și IPA comparativ cu grupul de control (Fig. suplimentară 4C). Interesant este că un model similar a fost observat și în cazul terapiei combinate, unde nu s-a observat nicio modificare a nivelurilor bazale și de stres ale ECAR comparativ cu tratamentul cu TGF-β1 (Fig. suplimentară 4C). În HSC-uri, reducerea fosforilării oxidative mitocondriale și capacitatea tratamentului combinat de a restabili SCR și BHI după expunerea la tratamentul cu TGF-β1 nu au modificat potențialul metabolic (OCR și ECAR). Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că IPA poate reduce bioenergetica în HSC-uri, sugerând că IPA poate induce un profil energetic mai scăzut care schimbă fenotipul HSC spre inactivare (Figura suplimentară 4D).
Efectul IPA asupra dinamicii mitocondriale a fost investigat utilizând cuantificarea tridimensională a morfologiei mitocondriale și a conexiunilor de rețea, precum și colorarea MTR (Figura 4 și Figura suplimentară 5). Figura 4 arată că, în comparație cu grupul de control, tratamentul cu TGF-β1 a scăzut suprafața medie, numărul de ramuri, lungimea totală a ramurilor și numărul de joncțiuni ale ramurilor (Figura 4A și B) și a modificat proporția mitocondriilor de la morfologie sferică la intermediară (Figura 4C). Doar tratamentul cu IPA a scăzut volumul mitocondrial mediu și a modificat proporția mitocondriilor de la morfologie sferică la intermediară în comparație cu grupul de control (Figura 4A). În schimb, sfericitatea, lungimea medie a ramurilor și activitatea mitocondrială evaluate prin MTR dependent de potențialul membranei mitocondriale (Figura 4A și E) au rămas neschimbate și acești parametri nu au diferit între grupuri. Luate împreună, aceste rezultate sugerează că tratamentul cu TGF-β1 și IPA par să moduleze forma și dimensiunea mitocondriilor, precum și complexitatea rețelei în celulele LX-2 vii.
IPA modifică dinamica mitocondrială și abundența ADN-ului mitocondrial în celulele LX-2. A. Imagini confocale reprezentative ale celulelor LX-2 vii incubate cu TGF-β1 (5 ng/ml) și 1 mM IPA timp de 24 de ore în mediu fără ser, prezentând rețele mitocondriale colorate cu Mitotracker™ Red CMXRos și nuclei colorați în albastru cu DAPI. Toate datele conțineau cel puțin 15 imagini per grup. Am achiziționat 10 imagini Z-stack pentru fiecare tip de probă. Fiecare secvență pe axa Z conținea 30 de felii, fiecare cu o grosime de 9,86 μm. Bara de scală: 10 μm. B. Obiecte reprezentative (doar mitocondrii) identificate prin aplicarea unei limitări adaptive a imaginii. Analiza cantitativă și compararea conexiunilor morfologice ale rețelei mitocondriale au fost efectuate pentru toate celulele din fiecare grup. C. Frecvența raporturilor de formă mitocondrială. Valorile apropiate de 0 indică forme sferice, iar valorile apropiate de 1 indică forme filamentoase. D Conținutul de ADN mitocondrial (ADNmt) a fost determinat așa cum este descris în Materiale și Metode. Analiza E Mitotracker™ Red CMXRos a fost efectuată prin citometrie în flux (30.000 de evenimente) așa cum este descris în Materiale și metode. Datele sunt prezentate ca medie ± DS, n = 3 experimente independente. Comparațiile statistice au fost efectuate utilizând ANOVA unidirecțională și testul Bonferroni post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Am analizat apoi conținutul de ADNmt din celulele LX-2 ca indicator al numărului de mitocondrii. Comparativ cu grupul de control, conținutul de ADNmt a fost crescut în grupul tratat cu TGF-β1 (Figura 4D). Comparativ cu grupul tratat cu TGF-β1, conținutul de ADNmt a fost scăzut în grupul cu tratament combinat (Figura 4D), sugerând că IPA poate reduce conținutul de ADNmt și, eventual, numărul de mitocondrii, precum și respirația mitocondrială (Figura 3C). Mai mult, IPA pare să reducă conținutul de ADNmt în tratamentul combinat, dar nu a afectat activitatea mitocondrială mediată de MTR (Figurile 4A-C).
Am investigat asocierea IPA cu nivelurile de ARNm ale genelor asociate cu fibroza, apoptoza, supraviețuirea și dinamica mitocondrială în celulele LX-2 (Figura 5A-D). Comparativ cu grupul de control, grupul tratat cu TGF-β1 a prezentat o expresie crescută a unor gene precum lanțul α2 de colagen de tip I (COL1A2), α-actina musculară netedă (αSMA), metaloproteinaza matriceală 2 (MMP2), inhibitorul tisular al metaloproteinazei 1 (TIMP1) și gena asemănătoare dinaminei 1 (DRP1), indicând o fibroză și o activare crescute. În plus, comparativ cu grupul de control, tratamentul cu TGF-β1 a redus nivelurile de ARNm ale receptorului nuclear pregnan X (PXR), caspazei 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitorului α al celulelor B, amplificatorului peptidei ușoare a genei factorului nuclear κ (NFκB1A) și inhibitorului subunității β a kinazei factorului nuclear κB (IKBKB) (Figura 5A-D). Comparativ cu tratamentul cu TGF-β1, tratamentul combinat cu TGF-β1 și IPA a redus expresia COL1A2 și MMP2, dar a crescut nivelurile de ARNm ale PXR, TIMP1, limfomului cu celule B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β și IKBKB. Tratamentul cu IPA a scăzut semnificativ expresia MMP2, proteinei X asociate cu Bcl-2 (BAX), AKT1, proteinei 1 a atrofiei optice (OPA1) și proteinei de fuziune mitocondrială 2 (MFN2), în timp ce expresia CASP8, NFκB1A, NFκB1B și IKBKB a fost crescută în comparație cu grupul de control. Cu toate acestea, nu s-a constatat nicio diferență în expresia caspazei-3 (CASP3), factorului 1 de activare a peptidazei apoptotice (APAF1), proteinei de fuziune mitocondrială 1 (MFN1) și proteinei de fisiune 1 (FIS1). Colectiv, aceste rezultate sugerează că tratamentul cu IPA modulează expresia genelor asociate cu fibroza, apoptoza, supraviețuirea și dinamica mitocondrială. Datele noastre sugerează că tratamentul cu IPA reduce fibroza în celulele LX-2; în același timp, stimulează supraviețuirea prin schimbarea fenotipului către inactivare.
IPA modulează expresia genelor fibroblaste, apoptotice, de viabilitate și dinamică mitocondrială în celulele LX-2. Histogramele afișează expresia ARNm în raport cu controlul endogen (RPLP0 sau PPIA) după ce celulele LX-2 au fost induse cu TGF-β1 și IPA în mediu fără ser timp de 24 de ore. A indică fibroblaste, B indică celule apoptotice, C indică celulele supraviețuitoare, iar D indică expresia genelor dinamice mitocondriale. Datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard (DS), n = 3 experimente independente. Comparațiile statistice au fost efectuate utilizând ANOVA cu o singură direcție și testul Bonferroni post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Apoi, modificările dimensiunii celulelor (FSC-H) și complexității citoplasmatice (SSC-H) au fost evaluate prin citometrie în flux (Figura 6A, B), iar modificările morfologiei celulare după tratamentul cu IPA au fost evaluate prin microscopie electronică de transmisie (TEM) și microscopie cu contrast de fază (Figura suplimentară 6A-B). Așa cum era de așteptat, celulele din grupul tratat cu TGF-β1 au crescut în dimensiune în comparație cu grupul de control (Figura 6A, B), arătând expansiunea clasică a reticulului endoplasmatic rugos (ER*) și a fagolizozomilor (P), indicând activarea celulelor stem hematopoietice (HSC) (Figura suplimentară 6A). Cu toate acestea, în comparație cu grupul tratat cu TGF-β1, dimensiunea celulelor, complexitatea citoplasmatică (Fig. 6A, B) și conținutul de ER* au fost scăzute în grupul de tratament combinat cu TGF-β1 și IPA (Figura suplimentară 6A). În plus, tratamentul cu IPA a redus dimensiunea celulelor, complexitatea citoplasmatică (Fig. 6A, B), conținutul de P și ER* (Fig. suplimentară 6A) comparativ cu grupul de control. În plus, conținutul de celule apoptotice a crescut după 24 de ore de tratament cu IPA comparativ cu grupul de control (săgeți albe, Fig. suplimentară 6B). Colectiv, aceste rezultate sugerează că 1 mM IPA poate stimula apoptoza HSC și poate inversa modificările parametrilor morfologici celulari induși de TGF-β1, reglând astfel dimensiunea și complexitatea celulelor, care pot fi asociate cu inactivarea HSC.
IPA modifică dimensiunea celulelor și complexitatea citoplasmatică în celulele LX-2. Imagini reprezentative ale analizei prin citometrie în flux. Analiza a utilizat o strategie de gating specifică celulelor LX-2: SSC-A/FSC-A pentru a defini populația celulară, FSC-H/FSC-A pentru a identifica dubletele și SSC-H/FSC-H pentru analiza dimensiunii și complexității celulelor. Celulele au fost incubate cu TGF-β1 (5 ng/ml) și 1 mM IPA în mediu fără ser timp de 24 de ore. Celulele LX-2 au fost distribuite în cadranul stâng inferior (SSC-H-/FSC-H-), cadranul stâng superior (SSC-H+/FSC-H-), cadranul drept inferior (SSC-H-/FSC-H+) și cadranul drept superior (SSC-H+/FSC-H+) pentru analiza dimensiunii celulelor și a complexității citoplasmatice. B. Morfologia celulară a fost analizată prin citometrie în flux utilizând FSC-H (împrăștiere frontală, dimensiunea celulei) și SSC-H (împrăștiere laterală, complexitate citoplasmatică) (30.000 de evenimente). Datele sunt prezentate ca medie ± SD, n = 3 experimente independente. Comparațiile statistice au fost efectuate utilizând ANOVA cu o singură direcție și testul Bonferroni post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 și ****p < 0,0001
Metaboliții intestinali precum IPA au devenit un subiect fierbinte de cercetare, sugerând că ar putea fi descoperite noi ținte în microbiota intestinală. Prin urmare, este interesant faptul că IPA, un metabolit pe care l-am asociat cu fibroza hepatică la om [15], s-a dovedit a fi un potențial compus antifibrotic în modelele animale [13, 14]. Aici, demonstrăm pentru prima dată o asociere între IPA seric și transcriptomica hepatică globală și metilarea ADN-ului la persoanele obeze fără diabet zaharat de tip 2 (DZT2), evidențiind apoptoza, mitofagia și longevitatea, precum și o posibilă genă candidată AKT1 care reglează homeostazia hepatică. O altă noutate a studiului nostru este că am demonstrat interacțiunea tratamentului cu IPA cu apoptoza, morfologia celulară, bioenergetica mitocondrială și dinamica în celulele LX-2, indicând un spectru energetic inferior care deplasează fenotipul HSC spre inactivare, făcând din IPA un potențial candidat pentru îmbunătățirea fibrozei hepatice.
Am constatat că apoptoza, mitofagia și longevitatea au fost cele mai importante căi canonice îmbogățite în gene hepatice asociate cu IPA seric circulant. Perturbarea sistemului de control al calității mitocondriale (MQC) poate duce la disfuncție mitocondrială, mitofagie și apoptoză, promovând astfel apariția MASLD [33, 34]. Prin urmare, putem specula că IPA ar putea fi implicat în menținerea dinamicii celulare și a integrității mitocondriale prin apoptoză, mitofagie și longevitate în ficat. Datele noastre au arătat că două gene au fost comune în cele trei teste: YKT6 și AKT1. Este demn de remarcat faptul că YKT6 este o proteină SNARE implicată în procesul de fuziune a membranei celulare. Aceasta joacă un rol în autofagie și mitofagie prin formarea unui complex de inițiere cu STX17 și SNAP29 pe autofagozom, promovând astfel fuziunea autofagozomilor și lizozomilor [35]. În plus, pierderea funcției YKT6 duce la afectarea mitofagiei[36], în timp ce creșterea expresiei YKT6 este asociată cu progresia carcinomului hepatocelular (HCC), demonstrând o supraviețuire celulară crescută[37]. Pe de altă parte, AKT1 este cea mai importantă genă interactivă și joacă un rol important în bolile hepatice, inclusiv în calea de semnalizare PI3K/AKT, ciclul celular, migrația celulară, proliferarea, aderența focală, funcția mitocondrială și secreția de colagen[38-40]. Calea de semnalizare PI3K/AKT activată poate activa celulele stem hematopoietice (HSC), care sunt celulele responsabile de producerea matricei extracelulare (MEC), iar disreglarea acesteia poate contribui la apariția și progresia fibrozei hepatice[40]. În plus, AKT este unul dintre factorii cheie de supraviețuire celulară care inhibă apoptoza celulară dependentă de p53, iar activarea AKT poate fi asociată cu inhibarea apoptozei celulelor hepatice[41, 42]. Rezultatele obținute sugerează că IPA poate fi implicat în apoptoza asociată mitocondriilor hepatice prin afectarea deciziei hepatocitelor între intrarea în apoptoză sau supraviețuire. Aceste efecte pot fi reglate de genele candidate AKT și/sau YKT6, care sunt esențiale pentru homeostazia hepatică.
Rezultatele noastre au arătat că IPA 1 mM a indus apoptoza și a scăzut respirația mitocondrială în celulele LX-2 independent de tratamentul cu TGF-β1. Este demn de remarcat faptul că apoptoza este o cale majoră pentru rezoluția fibrozei și activarea celulelor stem hematopoietice (HSC) și este, de asemenea, un eveniment cheie în răspunsul fiziologic reversibil al fibrozei hepatice [4, 43]. Mai mult, restaurarea BHI în celulele LX-2 după tratamentul combinat a oferit noi perspective asupra rolului potențial al IPA în reglarea bioenergeticii mitocondriale. În condiții de repaus și inactiv, celulele hematopoietice utilizează în mod normal fosforilarea oxidativă mitocondrială pentru a produce ATP și au o activitate metabolică scăzută. Pe de altă parte, activarea HSC îmbunătățește respirația și biosinteza mitocondrială pentru a compensa necesarul energetic de intrare în starea glicolitică [44]. Faptul că IPA nu a afectat potențialul metabolic și ECAR sugerează că calea glicolitică este mai puțin prioritizată. În mod similar, un alt studiu a arătat că 1 mM IPA a fost capabil să moduleze activitatea lanțului respirator mitocondrial în cardiomiocite, linia celulară de hepatocite umane (Huh7) și celulele endoteliale ale venei ombilice umane (HUVEC); Cu toate acestea, nu s-a constatat niciun efect al IPA asupra glicolizei în cardiomiocite, ceea ce sugerează că IPA poate afecta bioenergetica altor tipuri de celule [45]. Prin urmare, speculăm că 1 mM IPA poate acționa ca un decuplant chimic ușor, deoarece poate reduce semnificativ expresia genelor fibrogene, morfologia celulară și bioenergetica mitocondrială fără a modifica cantitatea de ADNmt [46]. Decuplanții mitocondriali pot inhiba fibroza indusă de cultură și activarea HSC [47] și pot reduce producția mitocondrială de ATP reglată sau indusă de anumite proteine, cum ar fi proteinele de decuplare (UCP) sau translocaza de adenină nucleotidă (ANT). În funcție de tipul de celulă, acest fenomen poate proteja celulele de apoptoză și/sau poate promova apoptoza [46]. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida rolul IPA ca decuplator mitocondrial în inactivarea celulelor stem hematopoietice.
Apoi am investigat dacă modificările respirației mitocondriale se reflectă în morfologia mitocondrială a celulelor LX-2 vii. Interesant este că tratamentul cu TGF-β1 modifică proporția mitocondrială de la sferică la intermediară, cu ramificare mitocondrială scăzută și expresie crescută a DRP1, un factor cheie în fisiunea mitocondrială [48]. Mai mult, fragmentarea mitocondrială este asociată cu complexitatea generală a rețelei, iar tranziția de la fuziune la fisiune este critică pentru activarea celulelor stem hematopoietice (HSC), în timp ce inhibarea fisiunii mitocondriale duce la apoptoza HSC [49]. Astfel, rezultatele noastre indică faptul că tratamentul cu TGF-β1 poate induce o scădere a complexității rețelei mitocondriale cu ramificare scăzută, care este mai frecventă în fisiunea mitocondrială asociată cu celulele stem hematopoietice activate (HSC). În plus, datele noastre au arătat că IPA ar putea schimba proporția mitocondriilor de la o formă sferică la una intermediară, reducând astfel expresia OPA1 și MFN2. Studiile au arătat că reglarea negativă a OPA1 ar putea provoca o scădere a potențialului membranei mitocondriale și ar putea declanșa apoptoza celulară [50]. Se știe că MFN2 mediază fuziunea mitocondrială și apoptoza [51]. Rezultatele obținute sugerează că inducerea celulelor LX-2 de către TGF-β1 și/sau IPA pare să moduleze forma și dimensiunea mitocondriilor, precum și starea de activare și complexitatea rețelei.
Rezultatele noastre indică faptul că tratamentul combinat cu TGFβ-1 și IPA ar putea reduce parametrii morfologici ai ADNmt și ai celulelor prin reglarea expresiei ARNm a genelor legate de fibroză, apoptoză și supraviețuire în celulele care evită apoptoza. Într-adevăr, IPA a scăzut nivelul de expresie a ARNm al AKT1 și al genelor importante de fibroză, cum ar fi COL1A2 și MMP2, dar a crescut nivelul de expresie al CASP8, care este asociat cu apoptoza. Rezultatele noastre au arătat că, după tratamentul cu IPA, expresia BAX a scăzut, iar expresia ARNm a subunităților familiei TIMP1, BCL-2 și NF-κB a crescut, sugerând că IPA ar putea stimula semnalele de supraviețuire în celulele stem hematopoietice (HSC) care evită apoptoza. Aceste molecule pot acționa ca semnale pro-supraviețuire în celulele stem hematopoietice activate, ceea ce poate fi asociat cu o expresie crescută a proteinelor anti-apoptotice (cum ar fi Bcl-2), o expresie scăzută a BAX pro-apoptotic și o interacțiune complexă între TIMP și NF-κB [5, 7]. IPA își exercită efectele prin PXR, iar am constatat că tratamentul combinat cu TGF-β1 și IPA a crescut nivelurile de expresie a ARNm a PXR, indicând suprimarea activării HSC. Se știe că semnalizarea PXR activată inhibă activarea HSC atât in vivo, cât și in vitro [52, 53]. Rezultatele noastre indică faptul că IPA poate participa la eliminarea HSC activate prin promovarea apoptozei, reducerea fibrozei și a metabolismului mitocondrial și amplificarea semnalelor de supraviețuire, care sunt procese tipice care convertesc fenotipul HSC activat într-unul inactivat. O altă posibilă explicație pentru mecanismul și rolul potențial al IPA în apoptoză este că acesta elimină mitocondriile disfuncționale în principal prin mitofagie (cale intrinsecă) și calea de semnalizare extrinsecă TNF (Tabelul 1), care este direct legată de calea de semnalizare a supraviețuirii NF-κB (Figura suplimentară 7). Interesant este că genele îmbogățite legate de IPA sunt capabile să inducă semnale pro-apoptotice și pro-supraviețuire în calea apoptotică [54], sugerând că IPA ar putea induce calea apoptotică sau supraviețuirea prin interacțiunea cu aceste gene. Cu toate acestea, modul în care IPA induce apoptoza sau supraviețuirea în timpul activării HSC și căile sale mecanistice rămân neclare.
IPA este un metabolit microbian format din triptofanul alimentar prin intermediul microbiotei intestinale. Studiile au arătat că are proprietăți antiinflamatorii, antioxidante și epigenetice de reglare în mediul intestinal.[55] Studiile au arătat că IPA poate modula funcția barierei intestinale și poate reduce stresul oxidativ, ceea ce poate contribui la efectele sale fiziologice locale.[56] De fapt, IPA este transportat către organele țintă prin circulație și, deoarece IPA are o structură similară a metabolitului principal cu triptofanul, serotonina și derivații de indol, IPA exercită acțiuni metabolice care duc la destin metabolic competitiv.[52] IPA poate concura cu metaboliții derivați din triptofan pentru locurile de legare pe enzime sau receptori, perturbând potențial căile metabolice normale. Acest lucru evidențiază necesitatea unor studii suplimentare privind farmacocinetica și farmacodinamica sa pentru a înțelege mai bine fereastra sa terapeutică.[57] Rămâne de văzut dacă acest lucru se poate întâmpla și în celulele stem hematopoietice (HSC).
Recunoaștem că studiul nostru are unele limitări. Pentru a examina în mod specific asocierile legate de IPA, am exclus pacienții cu diabet zaharat de tip 2 (DZT2). Recunoaștem că acest lucru limitează aplicabilitatea largă a descoperirilor noastre la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 și boală hepatică avansată. Deși concentrația fiziologică de IPA în serul uman este de 1-10 μM [11, 20], a fost aleasă o concentrație de 1 mM IPA pe baza celei mai mari concentrații netoxice [15] și a celei mai mari rate de apoptoză, fără nicio diferență în procentul populației de celule necrotice. Deși în acest studiu s-au utilizat niveluri suprafiziologice de IPA, în prezent nu există un consens cu privire la doza eficientă de IPA [52]. Deși rezultatele noastre sunt semnificative, soarta metabolică mai largă a IPA rămâne un domeniu activ de cercetare. Mai mult, descoperirile noastre privind asocierea dintre nivelurile serice de IPA și metilarea ADN-ului transcrierilor hepatice au fost obținute nu numai din celulele stem hematopoietice (HSC), ci și din țesuturile hepatice. Am ales să folosim celule LX-2 umane pe baza descoperirilor noastre anterioare din analiza transcriptomului, conform cărora IPA este asociat cu activarea celulelor stem hematopoietice (HSC) [15], iar HSC-urile sunt principalele celule implicate în progresia fibrozei hepatice. Ficatul este compus din mai multe tipuri de celule, așadar, alte modele celulare, cum ar fi sistemul de co-cultură hepatocite-HSC-celule imune, combinat cu activarea caspazei și fragmentarea ADN-ului, precum și mecanismul de acțiune, inclusiv nivelul proteinelor, ar trebui luate în considerare pentru a studia rolul IPA și interacțiunea sa cu alte tipuri de celule hepatice.