Vă mulțumim că ați vizitat nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați cea mai recentă versiune de browser (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). În plus, pentru a asigura asistență continuă, acest site nu va include stiluri sau JavaScript.
Sulfura de hidrogen (H2S) are multiple efecte fiziologice și patologice asupra organismului uman. Hidrosulfura de sodiu (NaHS) este utilizată pe scară largă ca instrument farmacologic pentru evaluarea efectelor H2S în experimentele biologice. Deși pierderea de H2S din soluțiile de NaHS durează doar câteva minute, soluțiile de NaHS au fost utilizate ca și compuși donori pentru H2S în apa potabilă în unele studii pe animale. Acest studiu a investigat dacă apa potabilă cu o concentrație de NaHS de 30 μM preparată în sticle de șobolan/șoarece poate rămâne stabilă timp de cel puțin 12-24 de ore, așa cum sugerează unii autori. Preparați o soluție de NaHS (30 μM) în apă potabilă și turnați-o imediat în sticle de apă de șobolan/șoarece. Probele au fost colectate de la vârful și interiorul sticlei de apă la 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 și 24 de ore pentru a măsura conținutul de sulfură folosind metoda albastrului de metilen. În plus, șobolanii masculi și femele au fost injectați cu NaHS (30 μM) timp de două săptămâni, iar concentrațiile serice de sulfură au fost măsurate o dată la două zile în prima săptămână și la sfârșitul celei de-a doua săptămâni. Soluția de NaHS din proba obținută din vârful sticlei de apă a fost instabilă; a scăzut cu 72%, respectiv 75% după 12, respectiv 24 de ore. În probele obținute din interiorul sticlelor de apă, scăderea NaHS nu a fost semnificativă în decurs de 2 ore; cu toate acestea, a scăzut cu 47%, respectiv 72% după 12, respectiv 24 de ore. Injecția de NaHS nu a afectat nivelul seric de sulfură la șobolanii masculi și femele. În concluzie, soluțiile de NaHS preparate din apă potabilă nu ar trebui utilizate pentru donarea de H2S, deoarece soluția este instabilă. Această cale de administrare va expune animalele la cantități neregulate și mai mici decât cele așteptate de NaHS.
Sulfura de hidrogen (H2S) a fost utilizată ca toxină încă din anul 1700; cu toate acestea, posibilul său rol ca moleculă de biosemnalizare endogenă a fost descris de Abe și Kimura în 1996. În ultimele trei decenii, numeroase funcții ale H2S în diverse sisteme umane au fost elucidate, ceea ce a dus la realizarea faptului că moleculele donoare de H2S pot avea aplicații clinice în tratamentul sau gestionarea anumitor boli; vezi Chirino și colab. pentru o analiză recentă.
Hidrosulfura de sodiu (NaHS) a fost utilizată pe scară largă ca instrument farmacologic pentru a evalua efectele H2S în numeroase studii pe culturi celulare și animale5,6,7,8. Cu toate acestea, NaHS nu este un donor ideal de H2S, deoarece este convertit rapid în H2S/HS- în soluție, este ușor contaminat cu polisulfuri și este ușor oxidat și volatilizat4,9. În multe experimente biologice, NaHS este dizolvat în apă, rezultând volatilizarea pasivă și pierderea de H2S10,11,12, oxidarea spontană a H2S11,12,13 și fotoliză14. Sulfura din soluția originală se pierde foarte rapid din cauza volatilizării H2S11. Într-un recipient deschis, timpul de înjumătățire (t1/2) al H2S este de aproximativ 5 minute, iar concentrația sa scade cu aproximativ 13% pe minut10. Deși pierderea hidrogenului sulfurat din soluțiile de NaHS durează doar câteva minute, unele studii pe animale au utilizat soluții de NaHS ca sursă de hidrogen sulfurat în apa potabilă timp de 1-21 de săptămâni, înlocuind soluția care conține NaHS la fiecare 12-24 de ore.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Această practică nu este în concordanță cu principiile cercetării științifice, deoarece dozele medicamentelor ar trebui să se bazeze pe utilizarea lor la alte specii, în special la oameni.27
Cercetarea preclinică în biomedicină își propune să îmbunătățească calitatea îngrijirii pacienților sau a rezultatelor tratamentului. Cu toate acestea, rezultatele majorității studiilor pe animale nu au fost încă transpuse la om28,29,30. Unul dintre motivele acestui eșec translațional este lipsa de atenție acordată calității metodologice a studiilor pe animale30. Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a investiga dacă soluțiile de NaHS de 30 μM preparate în sticle de apă de șobolan/șoarece pot rămâne stabile în apa potabilă timp de 12-24 de ore, așa cum se susține sau se sugerează în unele studii.
Toate experimentele din acest studiu au fost efectuate în conformitate cu ghidurile publicate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator în Iran31. Toate rapoartele experimentale din acest studiu au respectat, de asemenea, ghidurile ARRIVE32. Comitetul de Etică al Institutului de Științe Endocrine al Universității de Științe Medicale Shahid Beheshti a aprobat toate procedurile experimentale din acest studiu.
Acetatul de zinc dihidrat (CAS: 5970-45-6) și clorura ferică anhidră (CAS: 7705-08-0) au fost achiziționate de la Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Franța). Hidrosulfura de sodiu hidratată (CAS: 207683-19-0) și N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (CAS: 535-47-0) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Izofluranul a fost achiziționat de la Piramal (Bethlehem, PA, SUA). Acidul clorhidric (HCl) a fost achiziționat de la Merck (Darmstadt, Germania).
Preparați o soluție de NaHS (30 μM) în apă potabilă și turnați-o imediat în sticlele de apă pentru șobolani/șoareci. Această concentrație a fost aleasă pe baza numeroaselor publicații care utilizează NaHS ca sursă de H2S; consultați secțiunea Discuții. NaHS este o moleculă hidratată care poate conține cantități variabile de apă de hidratare (adică NaHS•xH2O); conform producătorului, procentul de NaHS utilizat în studiul nostru a fost de 70,7% (adică NaHS•1,3 H2O) și am luat în considerare această valoare în calculele noastre, unde am utilizat o greutate moleculară de 56,06 g/mol, care este greutatea moleculară a NaHS anhidru. Apa de hidratare (numită și apă de cristalizare) reprezintă moleculele de apă care alcătuiesc structura cristalină33. Hidrații au proprietăți fizice și termodinamice diferite în comparație cu anhidrații34.
Înainte de a adăuga NaHS în apa potabilă, măsurați pH-ul și temperatura solventului. Turnați imediat soluția de NaHS în sticla de apă pentru șobolani/șoareci din cușca animalului. Probele au fost colectate de la vârf și din interiorul sticlei de apă la 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 și 24 de ore pentru a măsura conținutul de sulfură. Măsurătorile de sulfură au fost efectuate imediat după fiecare prelevare de probe. Am obținut probe de la vârful tubului, deoarece unele studii au arătat că dimensiunea mică a porilor tubului de apă poate minimiza evaporarea H2S15,19. Această problemă pare să se aplice și soluției din sticlă. Cu toate acestea, acest lucru nu a fost valabil pentru soluția din gâtul sticlei de apă, care avea o rată de evaporare mai mare și era autooxidantă; de fapt, animalele au băut mai întâi această apă.
În studiu s-au utilizat șobolani Wistar masculi și femele. Șobolanii au fost adăpostiți în cuști de polipropilenă (2-3 șobolani per cușcă) în condiții standard (temperatură 21-26 °C, umiditate 32-40%) cu 12 ore de lumină (7:00 - 19:00) și 12 ore de întuneric (19:00 - 7:00). Șobolanii au avut acces liber la apă de la robinet și au fost hrăniți cu hrană standard (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Șobolanii Wistar femele (n=10, greutate corporală: 190-230 g) și masculi (n=10, greutate corporală: 320-370 g), de aceeași vârstă (6 luni), au fost împărțiți aleatoriu în grupuri de control și tratați cu NaHS (30 μM) (n=5 per grup). Pentru a determina dimensiunea eșantionului, am utilizat abordarea KISS (Keep It Simple, Stupid), care combină experiența anterioară cu analiza puterii de putere nutrițională35. Am efectuat mai întâi un studiu pilot pe 3 șobolani și am determinat nivelul mediu seric total de sulfură și deviația standard (8,1 ± 0,81 μM). Apoi, considerând o putere de 80% și presupunând un nivel de semnificație bilateral de 5%, am determinat o dimensiune preliminară a eșantionului (n = 5 pe baza literaturii anterioare) care a corespuns unei dimensiuni standardizate a efectului de 2,02 cu valoarea predefinită sugerată de Festing pentru calcularea dimensiunii eșantionului animalelor experimentale35. După înmulțirea acestei valori cu deviația standard (2,02 × 0,81), dimensiunea efectului detectabilă prezisă (1,6 μM) a fost de 20%, ceea ce este acceptabil. Aceasta înseamnă că n = 5/grup este suficient pentru a detecta o modificare medie de 20% între grupuri. Șobolanii au fost împărțiți aleatoriu în grupuri de control și tratați cu NaSH folosind funcția aleatorie a software-ului Excel36 (Figura suplimentară 1). Orbirea a fost efectuată la nivel de rezultat, iar investigatorii care au efectuat măsurătorile biochimice nu erau conștienți de repartizarea grupurilor.
Grupurile NaHS de ambele sexe au fost tratate cu o soluție de NaHS 30 μM preparată în apă potabilă timp de 2 săptămâni; Soluție proaspătă a fost furnizată la fiecare 24 de ore, timp în care s-a măsurat greutatea corporală. Probele de sânge au fost colectate de la vârfurile cozilor tuturor șobolanilor sub anestezie cu izofluran, o dată la două zile, la sfârșitul primei și celei de-a doua săptămâni. Probele de sânge au fost centrifugate la 3000 g timp de 10 minute, serul a fost separat și depozitat la –80°C pentru măsurarea ulterioară a ureei serice, creatininei (Cr) și sulfurii totale. Ureea serică a fost determinată prin metoda enzimatică a ureaza, iar creatinina serică a fost determinată prin metoda fotometrică Jaffe, utilizând kituri disponibile comercial (Man Company, Teheran, Iran) și un analizor automat (Selectra E, număr de serie 0-2124, Olanda). Coeficienții de variație intra- și inter-analiză pentru uree și Cr au fost mai mici de 2,5%.
Metoda cu albastru de metilen (MB) este utilizată pentru măsurarea sulfurii totale în apa potabilă și serul care conține NaHS; MB este cea mai frecvent utilizată metodă pentru măsurarea sulfurii în soluții vrac și probe biologice11,37. Metoda MB poate fi utilizată pentru a estima rezerva totală de sulfuri38 și pentru a măsura sulfurile anorganice sub formă de H2S, HS- și S2 în faza apoasă39. În această metodă, sulful este precipitat ca sulfură de zinc (ZnS) în prezența acetatului de zinc11,38. Precipitarea cu acetat de zinc este cea mai utilizată metodă pentru separarea sulfurilor de alți cromofori11. ZnS a fost redizolvat folosind HCl11 în condiții puternic acide. Sulfura reacționează cu DMPD într-un raport stoichiometric de 1:2 într-o reacție catalizată de clorură ferică (Fe3+ acționează ca agent oxidant) pentru a forma colorantul MB, care este detectat spectrofotometric la 670 nm40,41. Limita de detecție a metodei MB este de aproximativ 1 μM11.
În acest studiu, s-au adăugat într-un tub câte 100 μL din fiecare probă (soluție sau ser); apoi s-au adăugat 200 μL de acetat de zinc (1% g/v în apă distilată), 100 μL de DMPD (20 mM în HCl 7,2 M) și 133 μL de FeCl3 (30 mM în HCl 1,2 M). Amestecul a fost incubat la 37°C la întuneric timp de 30 de minute. Soluția a fost centrifugată la 10.000 g timp de 10 minute, iar absorbanța supernatantului a fost citită la 670 nm folosind un cititor de microplăci (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, SUA). Concentrațiile de sulfură au fost determinate folosind o curbă de calibrare a NaHS (0–100 μM) în ddH2O (Figura suplimentară 2). Toate soluțiile utilizate pentru măsurători au fost proaspăt preparate. Coeficienții de variație intra- și inter-analiză pentru măsurătorile de sulfură au fost de 2,8%, respectiv 3,4%. De asemenea, am determinat sulfura totală recuperată din probele de apă potabilă și ser care conțin tiosulfat de sodiu utilizând metoda probelor fortificate42. Recuperările pentru probele de apă potabilă și ser care conțin tiosulfat de sodiu au fost de 91 ± 1,1% (n = 6) și respectiv 93 ± 2,4% (n = 6).
Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul GraphPad Prism versiunea 8.0.2 pentru Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA, www.graphpad.com). Un test t pereche a fost utilizat pentru a compara temperatura și pH-ul apei potabile înainte și după adăugarea de NaHS. Pierderea de H2S în soluția care conține NaHS a fost calculată ca o scădere procentuală față de absorbția inițială, iar pentru a evalua dacă pierderea a fost semnificativă statistic, am efectuat o ANOVA cu măsurători repetate unidirecționale, urmată de testul de comparații multiple Dunnett. Greutatea corporală, ureea serică, creatinina serică și sulfura serică totală în timp au fost comparate între șobolanii de control și cei tratați cu NaHS de sexe diferite utilizând o ANOVA mixtă bidirecțională (între-în interiorul) urmată de un test post-hoc Bonferroni. Valorile P bilaterale < 0,05 au fost considerate semnificative statistic.
PH-ul apei potabile a fost de 7,60 ± 0,01 înainte de adăugarea de NaHS și de 7,71 ± 0,03 după adăugarea de NaHS (n = 13, p = 0,0029). Temperatura apei potabile a fost de 26,5 ± 0,2 și a scăzut la 26,2 ± 0,2 după adăugarea de NaHS (n = 13, p = 0,0128). Se prepară o soluție de NaHS 30 μM în apă potabilă și se depozitează într-o sticlă de apă. Soluția de NaHS este instabilă, iar concentrația sa scade în timp. La prelevarea probelor de la gâtul sticlei de apă, s-a observat o scădere semnificativă (68,0%) în prima oră, iar conținutul de NaHS din soluție a scăzut cu 72%, respectiv 75% după 12, respectiv 24 de ore. În probele obținute din sticle de apă, reducerea NaHS nu a fost semnificativă până la 2 ore, dar după 12 și 24 de ore a scăzut cu 47%, respectiv 72%. Aceste date indică faptul că procentul de NaHS dintr-o soluție de 30 μM preparată în apă potabilă a scăzut la aproximativ un sfert din valoarea inițială după 24 de ore, indiferent de locația de prelevare a probelor (Figura 1).
Stabilitatea soluției de NaHS (30 μM) în apa potabilă în sticle pentru șobolani/șoareci. După prepararea soluției, s-au prelevat probe din vârful și din interiorul sticlei de apă. Datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard (n = 6/grup). * și #, P < 0,05 comparativ cu timpul 0. Fotografia sticlei de apă prezintă vârful (cu deschidere) și corpul sticlei. Volumul vârfului este de aproximativ 740 μL.
Concentrația de NaHS în soluția proaspăt preparată de 30 μM a fost de 30,3 ± 0,4 μM (interval: 28,7–31,9 μM, n = 12). Cu toate acestea, după 24 de ore, concentrația de NaHS a scăzut la o valoare mai mică (medie: 3,0 ± 0,6 μM). După cum se arată în Figura 2, concentrațiile de NaHS la care au fost expuși șobolanii nu au fost constante pe parcursul perioadei de studiu.
Greutatea corporală a femelelor de șobolan a crescut semnificativ în timp (de la 205,2 ± 5,2 g la 213,8 ​​± 7,0 g în grupul de control și de la 204,0 ± 8,6 g la 211,8 ± 7,5 g în grupul tratat cu NaHS); cu toate acestea, tratamentul cu NaHS nu a avut niciun efect asupra greutății corporale (Fig. 3). Greutatea corporală a șobolanilor masculi a crescut semnificativ în timp (de la 338,6 ± 8,3 g la 352,4 ± 6,0 g în grupul de control și de la 352,4 ± 5,9 g la 363,2 ± 4,3 g în grupul tratat cu NaHS); cu toate acestea, tratamentul cu NaHS nu a avut niciun efect asupra greutății corporale (Fig. 3).
Modificări ale greutății corporale la șobolanii femele și masculi după administrarea de NaHS (30 μM). Datele sunt prezentate ca medie ± SEM și au fost comparate utilizând o analiză mixtă bidirecțională (în interiorul și între) a varianței cu testul post hoc Bonferroni. n = 5 din fiecare sex în fiecare grup.
Concentrațiile serice de uree și creatină fosfat au fost comparabile la șobolanii din grupul de control și la cei tratați cu NaSH pe tot parcursul studiului. În plus, tratamentul cu NaSH nu a afectat concentrațiile serice de uree și creatincrom (Tabelul 1).
Concentrațiile serice totale de sulfură inițială au fost comparabile între șobolanii masculi (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) și femele (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) din grupul de control și cei tratați cu NaHS. Administrarea de NaHS timp de 14 zile nu a avut niciun efect asupra nivelurilor serice totale de sulfură, nici la șobolanii masculi, nici la cei femele (Fig. 4).
Modificări ale concentrațiilor serice totale de sulfură la șobolanii masculi și femele după administrarea de NaHS (30 μM). Datele sunt prezentate ca medie ± SEM și au fost comparate utilizând o analiză mixtă (în cadrul grupului) a varianței cu testul post hoc Bonferroni. Fiecare sex, n = 5/grup.
Principala concluzie a acestui studiu este că apa potabilă care conține NaHS este instabilă: doar aproximativ un sfert din conținutul total inițial de sulfură poate fi detectat la 24 de ore după prelevarea probelor din vârful și din interiorul sticlelor de apă provenite de la șobolani/șoareci. În plus, șobolanii au fost expuși la concentrații instabile de NaHS din cauza pierderii de H2S în soluția de NaHS, iar adăugarea de NaHS în apa potabilă nu a afectat greutatea corporală, ureea serică și cromul creatinină sau sulfura serică totală.
În acest studiu, rata de pierdere a H2S din soluțiile de NaHS 30 μM preparate în apă potabilă a fost de aproximativ 3% pe oră. Într-o soluție tamponată (100 μM sulfură de sodiu în 10 mM PBS, pH 7,4), s-a raportat că concentrația de sulfură scade cu 7% în timp, pe parcursul a 8 ore11. Anterior, am susținut administrarea intraperitoneală a NaHS, raportând că rata de pierdere a sulfurii dintr-o soluție de NaHS 54 μM în apă potabilă a fost de aproximativ 2,3% pe oră (4%/oră în primele 12 ore și 1,4%/oră în ultimele 12 ore după preparare)8. Studii anterioare43 au constatat o pierdere constantă de H2S din soluțiile de NaHS, în principal din cauza volatilizării și oxidării. Chiar și fără adăugarea de bule, sulfura din soluția stoc se pierde rapid din cauza volatilizării H2S11. Studiile au arătat că în timpul procesului de diluare, care durează aproximativ 30-60 de secunde, aproximativ 5-10% din H2S se pierde din cauza evaporării6. Pentru a preveni evaporarea H2S din soluție, cercetătorii au luat mai multe măsuri, inclusiv agitarea ușoară a soluției12, acoperirea soluției stoc cu o folie de plastic6 și minimizarea expunerii soluției la aer, deoarece rata de evaporare a H2S depinde de interfața aer-lichid.13 Oxidarea spontană a H2S are loc în principal datorită ionilor metalelor de tranziție, în special a fierului feric, care sunt impurități în apă.13 Oxidarea H2S are ca rezultat formarea de polisulfuri (atomi de sulf legați prin legături covalente)11. Pentru a evita oxidarea sa, soluțiile care conțin H2S sunt preparate în solvenți dezoxigenați44,45 și apoi purjate cu argon sau azot timp de 20-30 de minute pentru a asigura dezoxigenarea.11,12,37,44,45,46 Acidul dietilentriaminpentaacetic (DTPA) este un chelator de metale (10-4 M) care previne autooxidarea HS- în soluții aerobe. În absența DTPA, rata de autooxidare a HS- este de aproximativ 50% pe parcursul a aproximativ 3 ore la 25°C37,47. În plus, deoarece oxidarea 1e-sulfurii este catalizată de lumina ultravioletă, soluția trebuie depozitată pe gheață și protejată de lumină11.
Așa cum se arată în Figura 5, NaHS se disociază în Na+ și HS-6 atunci când este dizolvat în apă; această disociere este determinată de pK1 al reacției, care depinde de temperatură: pK1 = 3,122 + 1132/T, unde T variază de la 5 la 30°C și se măsoară în grade Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- are un pK2 ridicat (pK2 = 19), astfel încât la pH < 96,49, S2- nu se formează sau se formează în cantități foarte mici. În schimb, HS- acționează ca o bază și acceptă H+ de la o moleculă de H2O, iar H2O acționează ca un acid și este convertit în H2S și OH-.
Formarea gazului H2S dizolvat în soluție de NaHS (30 µM). aq, soluție apoasă; g, gaz; l, lichid. Toate calculele presupun că pH-ul apei = 7,0 și temperatura apei = 20 °C. Creat cu BioRender.com.
În ciuda dovezilor că soluțiile de NaHS sunt instabile, mai multe studii pe animale au utilizat soluții de NaHS în apa potabilă ca și compus donor de H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, cu durate de intervenție cuprinse între 1 și 21 de săptămâni (Tabelul 2). În timpul acestor studii, soluția de NaHS a fost reînnoită la fiecare 12 ore, 15, 17, 18, 24, 25 de ore sau 24 de ore, 19, 20, 21, 22, 23 de ore. Rezultatele noastre au arătat că șobolanii au fost expuși la concentrații instabile de medicament din cauza pierderii de H2S din soluția de NaHS, iar conținutul de NaHS din apa potabilă a șobolanilor a fluctuat semnificativ pe parcursul a 12 sau 24 de ore (vezi Figura 2). Două dintre aceste studii au raportat că nivelurile de H2S din apă au rămas stabile pe parcursul a 24 de ore22 sau că s-au observat doar pierderi de H2S de 2-3% pe parcursul a 12 ore15, dar nu au furnizat date suplimentare sau detalii privind măsurătorile. Două studii au arătat că diametrul mic al sticlelor de apă poate minimiza evaporarea H2S15,19. Cu toate acestea, rezultatele noastre au arătat că acest lucru poate întârzia pierderea de H2S dintr-o sticlă de apă doar cu 2 ore, în loc de 12-24 de ore. Ambele studii notează că presupunem că nivelul de NaHS din apa potabilă nu s-a modificat deoarece nu am observat o schimbare de culoare a apei; prin urmare, oxidarea H2S cu aer nu a fost semnificativă19,20. În mod surprinzător, această metodă subiectivă evaluează stabilitatea NaHS în apă, mai degrabă decât să măsoare modificarea concentrației sale în timp.
Pierderea de H2S în soluția de NaHS este legată de pH și temperatură. După cum s-a menționat în studiul nostru, dizolvarea NaHS în apă duce la formarea unei soluții alcaline50. Când NaHS este dizolvat în apă, formarea gazului H2S dizolvat depinde de valoarea pH-ului6. Cu cât pH-ul soluției este mai mic, cu atât proporția de NaHS prezentă ca molecule de gaz H2S este mai mare și cu atât se pierde mai multă sulfură din soluția apoasă11. Niciunul dintre aceste studii nu a raportat pH-ul apei potabile utilizate ca solvent pentru NaHS. Conform recomandărilor OMS, care sunt adoptate de majoritatea țărilor, pH-ul apei potabile ar trebui să fie cuprins între 6,5 și 8,551. În acest interval de pH, rata de oxidare spontană a H2S crește de aproximativ zece ori13. Dizolvarea NaHS în apă în acest interval de pH va duce la o concentrație de gaz H2S dizolvat de 1 până la 22,5 μM, ceea ce subliniază importanța monitorizării pH-ului apei înainte de dizolvarea NaHS. În plus, intervalul de temperatură raportat în studiul menționat mai sus (18–26 °C) ar duce la o modificare a concentrației de gaz H2S dizolvat în soluție de aproximativ 10%, deoarece modificările de temperatură modifică pK1, iar mici modificări ale pK1 pot avea un impact semnificativ asupra concentrației de gaz H2S dizolvat48. În plus, durata lungă a unor studii (5 luni)22, timp în care se așteaptă o variabilitate mare a temperaturii, exacerbează, de asemenea, această problemă.
Toate studiile, cu excepția unuia21, au utilizat o soluție de NaHS 30 μM în apa potabilă. Pentru a explica doza utilizată (adică 30 μM), unii autori au subliniat că NaHS în faza apoasă produce exact aceeași concentrație de gaz H2S și că intervalul fiziologic al H2S este de 10 până la 100 μM, deci această doză se încadrează în intervalul fiziologic15,16. Alții au explicat că 30 μM NaHS poate menține nivelul plasmatic de H2S în intervalul fiziologic, adică 5–300 μM19,20. Considerăm o concentrație de NaHS în apă de 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), care a fost utilizată în unele studii pentru a studia efectele H2S. Putem calcula că concentrația de gaz H2S dizolvat este de 14,7 μM, ceea ce reprezintă aproximativ 50% din concentrația inițială de NaHS. Această valoare este similară cu valoarea calculată de alți autori în aceleași condiții13,48.
În studiul nostru, administrarea de NaHS nu a modificat greutatea corporală; acest rezultat este în concordanță cu rezultatele altor studii efectuate pe șoareci masculi22,23 și șobolani masculi18; Cu toate acestea, două studii au raportat că NaSH a restabilit greutatea corporală scăzută la șobolanii nefrectomizați24,26, în timp ce alte studii nu au raportat efectul administrării de NaSH asupra greutății corporale15,16,17,19,20,21,25. În plus, în studiul nostru, administrarea de NaSH nu a afectat nivelurile serice de uree și crom al creatinei, ceea ce este în concordanță cu rezultatele unui alt raport25.
Studiul a constatat că adăugarea de NaHS în apa potabilă timp de 2 săptămâni nu a afectat concentrațiile serice totale de sulfură la șobolanii masculi și femele. Această constatare este în concordanță cu rezultatele lui Sen și colab. (16): 8 săptămâni de tratament cu 30 μM NaHS în apa potabilă nu au afectat nivelurile plasmatice de sulfură la șobolanii de control; cu toate acestea, aceștia au raportat că această intervenție a restabilit nivelurile scăzute de H2S în plasma șoarecilor nefrectomizați. Li și colab. (22) au raportat, de asemenea, că tratamentul cu 30 μM NaHS în apa potabilă timp de 5 luni a crescut nivelurile plasmatice de sulfură liberă la șoarecii în vârstă cu aproximativ 26%. Alte studii nu au raportat modificări ale sulfurii circulante după adăugarea de NaHS în apa potabilă.
Șapte studii au raportat utilizarea Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, dar nu au oferit detalii suplimentare despre apa de hidratare, iar cinci studii nu au menționat sursa de NaHS utilizată în metodele lor de preparare17,18,24,25,26. NaHS este o moleculă hidratată, iar conținutul său de apă de hidratare poate varia, ceea ce afectează cantitatea de NaHS necesară pentru a prepara o soluție cu o anumită molaritate. De exemplu, conținutul de NaHS din studiul nostru a fost de NaHS•1,3 H2O. Prin urmare, concentrațiile reale de NaHS din aceste studii pot fi mai mici decât cele raportate.
„Cum poate un compus cu o durată atât de scurtă de viață să aibă un efect atât de lung?” Pozgay și colab.21 au pus această întrebare atunci când au evaluat efectele NaHS asupra colitei la șoareci. Ei speră că studiile viitoare vor putea răspunde la această întrebare și speculează că soluțiile de NaHS ar putea conține polisulfuri mai stabile, pe lângă H2S și disulfuri care mediază efectul NaHS21. O altă posibilitate este că și concentrațiile foarte scăzute de NaHS rămase în soluție ar putea avea un efect benefic. De fapt, Olson și colab. au furnizat dovezi că nivelurile micromolare de H2S din sânge nu sunt fiziologice și ar trebui să fie în intervalul nanomolar sau să lipsească complet13. H2S poate acționa prin sulfarea proteinelor, o modificare post-translațională reversibilă care afectează funcția, stabilitatea și localizarea multor proteine52,53,54. De fapt, în condiții fiziologice, aproximativ 10% până la 25% din multe proteine ​​hepatice sunt sulfilate53. Ambele studii recunosc distrugerea rapidă a NaHS19,23, dar afirmă în mod surprinzător că „am controlat concentrația de NaHS în apa potabilă prin înlocuirea zilnică a acestuia”.23 Un studiu a afirmat accidental că „NaHS este un donator standard de H2S și este utilizat în mod obișnuit în practica clinică pentru a înlocui H2S în sine”.18
Discuția de mai sus arată că NaHS se pierde din soluție prin volatilizare, oxidare și fotoliză și, prin urmare, se fac câteva sugestii pentru a reduce pierderea de H2S din soluție. În primul rând, evaporarea H2S depinde de interfața gaz-lichid13 și de pH-ul soluției11; prin urmare, pentru a minimiza pierderea prin evaporare, gâtul sticlei de apă poate fi făcut cât mai mic posibil, așa cum s-a descris anterior15,19, iar pH-ul apei poate fi ajustat la o limită superioară acceptabilă (adică 6,5–8,551) pentru a minimiza pierderea prin evaporare11. În al doilea rând, oxidarea spontană a H2S are loc din cauza efectelor oxigenului și a prezenței ionilor metalici de tranziție în apa potabilă13, astfel încât dezoxigenarea apei potabile cu argon sau azot44,45 și utilizarea chelatorilor metalici37,47 pot reduce oxidarea sulfurilor. În al treilea rând, pentru a preveni fotodescompunerea H2S, sticlele de apă pot fi învelite cu folie de aluminiu; Această practică se aplică și materialelor sensibile la lumină, cum ar fi streptozotocina55. În cele din urmă, sărurile sulfurice anorganice (NaHS, Na2S și CaS) pot fi administrate prin gavaj, în loc să fie dizolvate în apa potabilă, așa cum s-a raportat anterior56,57,58; studiile au arătat că sulfura de sodiu radioactivă administrată prin gavaj la șobolani este bine absorbită și distribuită în aproape toate țesuturile59. Până în prezent, majoritatea studiilor au administrat săruri sulfurice anorganice intraperitoneal; cu toate acestea, această cale este rar utilizată în contexte clinice60. Pe de altă parte, calea orală este cea mai comună și preferată cale de administrare la om61. Prin urmare, recomandăm evaluarea efectelor donorilor de H2S la rozătoare prin gavaj oral.
O limitare este faptul că am măsurat sulfura în soluție apoasă și ser folosind metoda MB. Metodele de măsurare a sulfurii includ titrarea iodului, spectrofotometria, metoda electrochimică (potențiometrie, amperometrie, metodă coulometrică și metodă amperometrică) și cromatografia (cromatografie gazoasă și cromatografie lichidă de înaltă performanță), dintre care cea mai frecvent utilizată metodă este metoda spectrofotometrică MB62. O limitare a metodei MB pentru măsurarea H2S în probele biologice este aceea că măsoară toți compușii care conțin sulf și nu H2S63 liber, deoarece se efectuează în condiții acide, ceea ce duce la extracția sulfului din sursa biologică64. Cu toate acestea, conform Asociației Americane de Sănătate Publică, MB este metoda standard pentru măsurarea sulfurii în apă65. Prin urmare, această limitare nu afectează principalele noastre rezultate privind instabilitatea soluțiilor care conțin NaHS. În plus, în studiul nostru, recuperarea măsurătorilor de sulfură în probele de apă și ser care conțin NaHS a fost de 91%, respectiv 93%. Aceste valori sunt în conformitate cu intervalele raportate anterior (77–92)66, indicând o precizie analitică acceptabilă42. Este demn de remarcat faptul că am utilizat atât șobolani masculi, cât și femele, în conformitate cu ghidurile Institutului Național de Sănătate (NIH) pentru a evita dependența excesivă de studiile efectuate exclusiv pe animale de sex masculin în studiile preclinice67 și pentru a include atât șobolani masculi, cât și femele, ori de câte ori este posibil68. Acest aspect a fost subliniat și de alții69,70,71.
În concluzie, rezultatele acestui studiu indică faptul că soluțiile de NaHS preparate din apă potabilă nu pot fi utilizate pentru a genera H2S din cauza instabilității lor. Această cale de administrare ar expune animalele la niveluri instabile și mai mici decât cele așteptate de NaHS; prin urmare, este posibil ca rezultatele să nu fie aplicabile la oameni.
Seturile de date utilizate și/sau analizate în cadrul studiului actual sunt disponibile de la autorul corespondent, la cerere rezonabilă.
Szabo, K. Cronologia cercetării hidrogenului sulfurat (H2S): de la toxină de mediu la mediator biologic. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. și Kimura, H. Posibil rol al hidrogenului sulfurat ca neuromodulator endogen. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. și Papapetropoulos, A. Rolul fiziologic al hidrogenului sulfurat în celulele, țesuturile și organele mamiferelor. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB și Kashfi, K. Promisiunea în evoluție a sistemelor de administrare celulară pentru oxidul nitric și hidrogenul sulfurat: o nouă eră a medicinei personalizate. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. și colab. Administrarea pe termen lung a unui donor de hidrogen sulfurat cu eliberare lentă poate preveni ischemia miocardică/leziunile de reperfuzie. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM și Hermann, A. Fosforilarea canalului BK reglează sensibilitatea la hidrogen sulfurat (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM și Hermann, A. Hidrogenul sulfurat amplifică activitatea canalului de potasiu activat de calciu (BK) în celulele tumorale pituitare de șobolan. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. și colab. Hidrogenul sulfurat sporește efectul protector al nitriților împotriva leziunilor miocardice de ischemie-reperfuzie la șobolanii cu diabet zaharat de tip 2. Oxid nitric 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. și colab. Tendințe în chimia donorilor de H2S și impactul acesteia asupra bolilor cardiovasculare. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF și Olson, KR (2012). Pierderi pasive de hidrogen sulfurat în experimente biologice. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. și colab. Aspecte chimice ale măsurătorilor de hidrogen sulfurat în probe fiziologice. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Determinarea spectrofotometrică a hidrogenului sulfurat în apele naturale. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Instruire practică în chimia și biologia hidrogenului sulfurat. „Antioxidanți”. Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).