Sortarea proteinelor în calea secretorie este esențială pentru menținerea compartimentării celulare și a homeostaziei. Pe lângă sortarea mediată de înveliș, rolul lipidelor în sortarea kinesinei în procesul de transport secretor este o întrebare fundamentală de lungă durată care nu a primit încă răspuns. Aici, efectuăm imagistică 3D simultană multicoloră de înaltă rezoluție în timp real pentru a demonstra in vivo că proteinele imobilizate cu glicozilfosfatidilinozitol nou sintetizate, cu fragmente lipidice de ceramidă foarte lungi, sunt grupate și clasificate în situsuri de ieșire netă specializate ale endoplasmelor, care sunt diferite de cele utilizate de proteinele transmembranare. În plus, arătăm că lungimea lanțului ceramidei în membrana reticulului endoplasmatic este critică pentru această selectivitate de sortare. Studiul nostru oferă primele dovezi directe in vivo pentru clasificarea încărcăturilor de proteine ​​pe baza lungimii lanțului lipidic în situsuri de export selective în calea secretorie.
În celulele eucariote, proteinele sintetizate în reticulul endoplasmatic (RE) sunt apoi sortate în timpul transportului prin calea secretorie pentru a fi livrate la destinația celulară corespunzătoare (1). Pe lângă sortarea mediată de înveliș, s-a speculat mult timp că anumite lipide pot servi și ca puncte de ieșire selective prin gruparea lor în domenii membranare specifice proteinelor specifice (2-5). Cu toate acestea, există încă o lipsă de dovezi directe in vivo care să demonstreze acest posibil mecanism bazat pe lipide. Pentru a rezolva această problemă fundamentală, am studiat la drojdie modul în care proteinele ancorate în glicozilfosfatidilinozitol (GPI) (GPI-AP) sunt exportate diferențiat din RE. GPI-AP sunt o varietate de proteine ​​de suprafață celulară conectate la lipide (6, 7). GPI-AP este o proteină secretată atașată la foițele exterioare ale membranei plasmatice prin intermediul fragmentului glicolipidic (ancora GPI). Acestea acceptă ancorele GPI ca modificări post-translaționale conservatoare în lumenul RE (8). După atașare, GPI-AP trece prin aparatul Golgi (5, 9) de la RE la membrana plasmatică. Prezența ancorelor GPI determină transportul GPI-AP separat de proteinele secretate transmembranar (inclusiv alte proteine ​​ale membranei plasmatice) de-a lungul căii secretorii (5, 9, 10). În celulele de drojdie, GPI-AP sunt separate de alte proteine ​​secretate în reticulul endoplasmatic și apoi ambalate în vezicule unice învelite de complexul proteic de înveliș II (COPII) (6, 7). Factorii determinanți ai acestui proces de clasificare în procesul de export al RE sunt neclari, dar se speculează că acest mecanism ar putea necesita lipide, în special remodelarea structurală a porțiunii lipidice a ancorei GPI (5, 8). La drojdie, remodelarea lipidelor GPI începe imediat după ce GPI se atașează și, în multe cazuri, determină legarea ceramidei de acidul gras saturat cu lanț lung cu 26 de atomi de carbon (C26:0) (11, 12). Ceramida C26 este principala ceramidă produsă de celulele de drojdie până în prezent. Este sintetizată în RE și cea mai mare parte este exportată către aparatul Golgi prin vezicule COPII (13). Exportul GPI-AP în RE necesită în mod specific sinteza continuă a ceramidei (14, 15) și, la rândul său, conversia ceramidei în ceramidă de inozitol fosfat (IPC) în aparatul Golgi depinde de sinteza ancorei GPI (16). Studiile biofizice cu membrane artificiale au arătat că ceramidele cu lanț acil foarte lung se pot uni pentru a forma domenii ordonate cu proprietăți fizice unice (17, 18). Aceste date conduc la ipoteza că ceramida C26 și GPI-AP cu ceramida C26 își folosesc proprietățile fizice pentru a se uni în regiuni ordonate sau regiuni în mediul lipidic relativ dezordonat al membranei RE. Este compusă în principal din glicerolipide scurte și nesaturate (C16:1 și C18:1) (19, 20). Aceste regiuni vor fi focalizate selectiv pe anumite situsuri de ieșire din reticulul endoplasmatic (RE), unde ceramida și GPI-AP pe bază de ceramidă pot fi co-transportate către aparatul Golgi în aceeași veziculă COPII dedicată (5).
În acest studiu, am testat direct acest mecanism bazat pe lipide utilizând microscopia confocală de imagistică în timp real cu super-rezoluție (SCLIM), o tehnică de microscopie de ultimă generație care poate observa simultan proteine ​​marcate fluorescent. Imaginile tricolore și tridimensionale (3D) au o rezoluție și o viteză extrem de ridicate în celulele vii (21, 22).
Am aplicat mai întâi tehnologia SCLIM pentru a defini mai detaliat modul în care GPI-AP normală cu gruparea ceramidă C26 a fost selectată din proteinele secretate transmembranar după părăsirea RE în S. cerevisiae. Pentru a verifica clasificarea RE, am utilizat un sistem genetic care poate vizualiza direct încărcătura nou sintetizată care intră în RE in vivo (7, 23). Ca încărcătură, am ales GPI-AP Gas1 pe bază de ceramidă C26 marcată cu proteină fluorescentă verde (GFP) și proteina secretată transmembranar Mid2 marcată cu proteină fluorescentă în infraroșu apropiat (iRFP), ambele vizând membrana plasmatică (24-26). În mutantul sensibil la temperatură sec31-1, aceste două încărcături sunt exprimate sub un promotor inductibil de galactoză și un marker ERES constitutiv. La temperatură extremă (37°C), deoarece mutația sec31-1 afectează funcția componentei de înveliș COPII Sec31 de a inhiba germinarea COPII și exportul RE, încărcătura nou sintetizată se acumulează la RE (23). După răcire la o temperatură scăzută (24°C), celulele mutante sec31-1 s-au recuperat din zona secretorie, iar noua încărcătură sintetică acumulată a început să fie exportată din RE. Vizualizarea CLIM a arătat că majoritatea Gas1-GFP și Mid2-iRFP nou sintetizate se acumulau încă în RE-ul celulelor mutante sec31-1 după incubare la 37°C și apoi au fost eliberate la 24°C timp de 5 minute (Figura 1). Deoarece Mid2-iRFP este distribuit pe întreaga membrană RE, iar Gas1-GFP este concentrat și adunat în zona discontinuă a membranei RE, distribuția lor este complet diferită (Figura 1, A-C și Filmul S1). În plus, așa cum se arată în Figura 1D, clusterul Gas1-GFP nu are Mid2-iRFP. Aceste rezultate indică faptul că GPI-AP și proteinele transmembranare au fost separate devreme în diferite regiuni ale membranei RE. Clusterul Gas1-GFP este adiacent unui ERES specific marcat cu proteina de înveliș Sec13 a COPII a mCherry (Figura 1, E și F, și filmul S1) (23).
Celulele sec31-1 exprimă secreții induse de galactoză, o ceramidă cu lanț acil lung (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) și proteina transmembranară Mid2-iRFP (TMP, albastru), iar această marcare ERES constructivă Sec13-mCherry (ERES, magenta) a fost incubată la 37°C timp de 30 de minute, mutată la 24°C și imagistică prin SCLIM 5 minute mai târziu. (A până la C) prezintă o imagine 2D reprezentativă îmbinată sau unică a unui plan (A), o imagine de proiecție 2D a 10 secțiuni z (B) sau o imagine 3D a emisferei celulare a încărcăturii și markerilor ERES (C). Bara de scală 1 μm (A și B). Unitatea de scală este de 0,551 μm (C). Gas1-GFP a fost detectat în regiuni sau clustere discrete ale RE, în timp ce Mid2-iRFP a fost detectat și distribuit în întreaga membrană a RE (C). (D) Graficul prezintă intensitatea relativă a fluorescenței Gas1-GFP și Mid2-iRFP în clusterul Gas1-GFP de-a lungul liniei săgeții albe (stânga). AU, unitate arbitrară. (E și F) reprezintă imaginea 3D care combină marcajele goods și ERES. Clusterele Gas1-GFP au fost detectate în apropierea ERES-ului specific. Unitatea de scară este de 0,551 μm. (F) Săgeata albă continuă marchează clusterul Gas1-GFP asociat cu ERES. Panourile din mijloc și din dreapta prezintă imaginea 3D mărită îmbinată și o vedere rotită a clusterului Gas1-GFP selectat.
Relația spațială strânsă dintre clusterul Gas1-GFP și un ERES specific indică faptul că Gas1-GFP poate intra în ERES selectiv, ceea ce este diferit de selectivitatea utilizată de Mid2-iRFP pentru a părăsi RE. Pentru a aborda această posibilitate, am cuantificat raportul ERES doar pentru unul sau două bunuri (Figura 2, A-C). Am constatat că majoritatea ERES (70%) conțin un singur tip de încărcătură. Imaginea de jos a Figurii 2C prezintă două exemple tipice de ERES doar cu Gas1-GFP (Figura 1) sau doar Mid2-iRFP (Figura 2). În schimb, aproximativ 20% din ERES conțin două încărcături care se suprapun în aceeași zonă. S-a constatat că unele ERES (10%) conțineau două tipuri de încărcături, dar acestea erau izolate în zone clar diferite. Prin urmare, această analiză statistică arată că, după ce RE este exportat, GPI-AP Gas1-GFP și încărcătura transmembranară Mid2-iRFP sunt împărțite în ERES diferite (Figura 2D). Această eficiență de sortare este foarte consistentă cu analiza biochimică anterioară (6) și determinarea morfologică (7). De asemenea, putem observa comportamentul încărcăturii aflate în carantină care intră în ERES (Figura 2E și Filmul S2). Figura 2E arată că doar o mică porțiune de Gas1-GFP (panoul 3) sau Mid2-iRFP (panoul 4) intră în ERES dintr-o parte și este limitată într-o zonă discretă. Panoul 5 din Figura 2E arată că Gas1-GFP și Mid2-iRFP se găsesc uneori în același ERES, dar intră din părți diferite și sunt concentrate în regiuni separate care pot reprezenta vezicule COPII diferite. De asemenea, am confirmat că separarea și clasificarea observate a GPI-AP Gas1 pe bază de ceramidă C26 ca ERES selectiv este specifică deoarece o altă încărcătură secretată transmembranară, proteina membranei plasmatice Axl2 (27) marcată cu GFP, prezintă un comportament similar cu Mid2-iRFP. (Imaginea S1 și Filmul S3). Axl2-GFP nou sintetizat este distribuit prin membrana RE, la fel ca Mid2-iRFP (Figura S1, A și B) și este co-localizat cu Mid2-iRFP în majoritatea ERES (Figura S1, B-D). Panourile 1 și 2 din Figura 1. S1C prezintă două exemple tipice de ERES în care două încărcături transmembranare se suprapun. În aceste cazuri, ambele mărfuri intră împreună în ERES (Figura S1E, Panoul 3 și Filmul S3).
Celulele sec31-1 care exprimă secreții inductibile de galactoză, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) și Mid2-iRFP (TMP, albastru) și marcarea ERES constitutivă Sec13-mCherry (ERES, magenta) au fost plasate la 37°C. După incubare timp de 30 de minute la °C, se trece la 24°C pentru a elibera blocul de secreție și se realizează o imagine cu SCLIM după 20 de minute. (A până la C) Imagini reprezentative de proiecție 2D (A; bară de scală, 1 μm) sau imagini 3D ale emisferei celulare (B și C; unitate de scală, 0,456 μm) ale încărcăturii și 10 secțiuni z marcate cu ERES. Panoul inferior din (B) și panoul din (C) afișează imagini procesate pentru a afișa doar mărfurile prezente în ERES (magenta) [Gas1-GFP (gri) și Mid2-iRFP (albastru deschis)]. (C) Săgeată deschisă: ERES transportă o singură piesă de încărcătură (1 până la 4). Săgeată gri: ERES conține marfă segregată (5). Săgeată albă continuă: ERES conține marfă colocată. Mai jos: ERES-ul singular selectat conține doar Gas1-GFP (1) sau Mid2-iRFP (2). Bara de scală, 100 nm. (D) Cuantificarea microfotografiei descrise în (C). Procentul mediu de ERES care conține o singură marfă (Gas1-GFP sau Mid2-iRFP), marfă segregată și marfă suprapusă. În trei experimente independente, n=432 în 54 de celule. Bara de eroare = SD. Test t bilateral nepereche. *** P = 0,0002. (E) Imagine 3D a ERES-ului selectat din marfă în carantină marcată cu (C). Gas1-GFP (verde) (3) sau Mid2-iRFP (albastru) (4) intră în ERES (magenta) dintr-o parte și este restricționat la o zonă mică din cadrul ERES. Uneori, ambele tipuri de marfă intră în același ERES (5) din aceeași parte și sunt limitate la o zonă izolată din cadrul ERES. Bara de scală, 100 nm.
În continuare, am testat ipoteza conform căreia ceramida cu lanț acil lung (C26) prezentă în membrana RE determină gruparea și sortarea specifică a Gas1 în ERES selectiv. În acest scop, am utilizat o tulpină de drojdie modificată GhLag1, în care cele două sintaze de ceramidă endogene Lag1 și Lac1 au fost înlocuite de GhLag1 (omologul Lag1 al bumbacului), rezultând o tulpină de drojdie cu o membrană celulară mai scurtă decât cea a tipului sălbatic (Figura 3A) (28). Analiza prin spectrometrie de masă (MS) a arătat că în tulpinile de tip sălbatic, 95% din totalul de ceramidă este ceramidă cu lanț foarte lung (C26), în timp ce în GhLag1, 85% din ceramidă este foarte lungă (C18 și C16), doar 2% din ceramidă este ceramidă cu lanț foarte lung (C26). Deși ceramidele C18 și C16 sunt principalele ceramide detectate până în prezent în membrana GhLag1, analiza MS a confirmat, de asemenea, că ancora GPI a Gas1-GFP exprimată în tulpina GhLag1 conține ceramidă C26, care este comparabilă cu lipidele de tip sălbatic. Calitatea este aceeași (Fig. 3A) (26). Prin urmare, aceasta înseamnă că enzima de remodelare a ceramidei Cwh43 este foarte selectivă pentru ceramida C26, așa cum se arată în Figura 26, aceasta încorporând preferențial ancora GPI dintr-o cantitate mică de ceramidă C26 în tulpina GhLag1. S2 (29). Cu toate acestea, membrana celulară a GhLag1 conține practic doar ceramidă C18-C16, în timp ce Gas1-GFP are încă ceramidă C26. Acest fapt face ca această tulpină să fie un instrument ideal pentru a rezolva în mod specific problema lungimii lanțului acil al ceramidei membranare în RE. Rolul ipotetic al clasei și sortării. Apoi, am studiat mai întâi capacitatea C26 Gas1-GFP de a se acumula în clustere în GhLag1 cu o alelă mutantă sensibilă la temperatură a sec31-1 prin microscopie fluorescentă convențională, unde doar lanțul lung (C18-C16) există în membrana RE (Fig. 3). Am observat că în sec31-1, cea mai mare parte a Gas1-GFP a fost concentrată în clustere, în timp ce Gas1-GFP în sec31-1 GhLag1 cu ceramidă lungă (C18-C16) nu a fost în mare parte grupat și distribuit în întreaga membrană RE. Mai precis, deoarece gruparea pe bază de ceramidă C26 este strâns legată de ERES specifice (Figura 1), am investigat în continuare dacă acest proces poate implica și funcția mecanismului proteinei de export RE. GPI-AP utilizează un sistem COPII special pentru exportul RE, care este reglat activ de remodelarea structurală de către Ted1 a porțiunii glican a ancorei GPI (30, 31). GPI-glicanul recombinant este apoi recunoscut de complexul receptorului transmembranar cargo p24, care la rândul său recrutează selectiv Lst1, care este o izoformă specifică a subunității principale de legare a cargoului COPII Sec24, formând o subunitate COPII bogată în GPI-AP. Sunt necesare vezicule (31-33). Prin urmare, am construit un mutant dublu care a combinat deleția acestor proteine ​​individuale (componenta complexului p24 Emp24, enzima de remodelare GPI-glican Ted1 și subunitatea specifică COPII Lst1) cu tulpina mutantă sec31-1 și le-am studiat. Este posibil să se formeze GFP Gas1-cluster (Figura 3)? Am observat că în sec31-1emp24Δ și sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP este în principal neclusterizat și distribuit în întreaga membrană RE, așa cum s-a observat anterior în sec31-1 GhLag1, în timp ce în sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP este similar cu sec31-1. Aceste rezultate indică faptul că, pe lângă prezența ceramidei C26 în membrana RE, gruparea Gas1-GFP trebuie să se lege și de complexul p24 și nu necesită recrutare specifică Lst1. Apoi, am explorat posibilitatea ca lungimea lanțului ceramidei în membrana RE să poată regla legarea Gas1-GFP la p24. Cu toate acestea, am descoperit că prezența ceramidei C18-C16 în membrană nu afectează GPI-glicanii reconstruiți de complexul p24 (Figurile S3 și S4, A și B) sau legarea la GPI-AP și exportul de GPI-AP. Recrutarea subtipului COPII Lst1 (Figura S4C). Prin urmare, gruparea dependentă de ceramidă C26 nu necesită interacțiuni proteice cu diferite mecanisme de export al proteinelor din RE, ci susține un mecanism alternativ de sortare determinat de lungimea lipidelor. Apoi, am analizat dacă lungimea lanțului acil al ceramidei în membrana RE este importantă pentru clasificarea eficientă a Gas1-GFP ca ERES selectiv. Întrucât Gas1 din tulpina GhLag1 cu ceramidă cu lanț scurt părăsește RE și intră în membrana plasmatică (Figura S5), credem că, dacă sortarea este determinată de lungimea lanțului acil al ceramidei, Gas1 din tulpina GhLag1 poate fi redirecționat și încrucișat. Bunuri ERES cu aceeași membrană.
(A) Membrana celulară a GhLag1 conține în principal ceramide C18-C16 mai scurte, în timp ce ancora GPI a Gas1-GFP are în continuare același IPC C26 ca și celulele de tip sălbatic. Mai sus: analiza lungimii lanțului acil al ceramidei în membrana celulară a tulpinilor de tip sălbatic (Wt) și GhLag1p prin spectrometrie de masă (MS). Datele reprezintă procentul de ceramidă totală. Media a trei experimente independente. Bara de eroare = SD. Test t bilateral nepereche. **** P <0,0001. Panoul inferior: Analiza MS a lungimii lanțului acil al IPC prezent în ancora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) exprimată în tulpinile de tip sălbatic și GhLag1p. Datele reprezintă procentul de semnal IPC total. Media a cinci experimente independente. Bara de eroare = SD. Test t bilateral nepereche. ns, neimportant. P = 0,9134. (B) Micrografii cu fluorescență ale celulelor sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ și sec31-1lst1Δ care exprimă Gas1-GFP indus de galactoză au fost incubate la 37°C timp de 30 de minute și transmise la... Efectuați microscopie cu fluorescență de rutină după 24°C. Săgeată albă: Cluster Gas1-GFP din RE. Săgeată deschisă: Gas1-GFP neclusterizat este distribuit pe întreaga membrană RE, prezentând colorarea caracteristică a inelului nuclear RE. Bară de scală, 5 μm. (C) Cuantificarea microfotografiei descrise în (B). Procentul mediu de celule cu structură punctată Gas1-GFP. În trei experimente independente, n ≥ 300 celule. Bara de eroare = SD. Test t bilateral nepereche. **** P ＜ 0,0001.
Pentru a rezolva direct această problemă, am efectuat o vizualizare SCLIM a Gas1-GFP și Mid2-iRFP în GhLag1 cu alela mutantă sensibilă la temperatură sec31-1 (Figura 4 și Filmul S4). După ce RE a fost reținut la 37°C și ulterior eliberat la 24°C, cea mai mare parte a Gas1-GFP nou sintetizat nu a fost grupat și distribuit în întreaga membrană RE, așa cum s-a observat la microscoapele convenționale (Figura 4, A și B). În plus, un procent mare de ERES (67%) include două tipuri de încărcătură colocalizată în acesta (Figura 4D). Panourile 1 și 2 din Figura 4C prezintă două exemple tipice de ERES cu Gas1-GFP și Mid2-GFP suprapuse. În plus, ambele bunuri au fost recrutate în același ERES (Figura 4E, panoul 3 și filmul S4). Prin urmare, rezultatele noastre indică faptul că lungimea lanțului acil de ceramidă din membrana RE este un factor determinant important al agregării și clasificării proteinelor RE.
Celule Sec31-1 GhLag1 care exprimă secreții induse de galactoză, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) și Mid2-iRFP (TMP, albastru) și Sec13-mCherry marcat cu ERES constitutiv (ERES, magenta). Se incubează la 37°C. Se continuă timp de 30 de minute, se scade temperatura la 24°C pentru a elibera secrețiile și se realizează o imagine cu SCLIM după 20 de minute. (A până la C) Imagini reprezentative de proiecție 2D (A; bară de scală, 1 μm) sau imagini 3D ale emisferei celulare (B și C; unitate de scală, 0,45 μm) ale celor 10 secțiuni z marcate de încărcătură și ERES. Panoul inferior din (B) și panoul din (C) afișează imagini procesate pentru a afișa doar bunurile prezente în ERES (magenta) [Gas1-GFP (gri) și Mid2-iRFP (albastru deschis)]. (C) Săgeată umplută cu alb: ERES, bunurile se suprapun. Săgeată deschisă: ERES conține un singur element. Panoul inferior: ERES-ul selectat are mărfuri suprapuse (1 și 2) marcate în (C). Bara de scală, 100 nm. (D) Cuantificarea microfotografiei descrise în (C). În unitățile sec31-1 și sec31-1 GhLag1, este inclusă o singură încărcătură (Gas1-GFP sau Mid2-iRFP) și procentul mediu de ERES pentru încărcătura izolată și încărcătura suprapusă. În trei experimente independente, n = 432 în 54 de celule (sec31-1) și n = 430 în 47 de celule (sec31-1 GhLag1). Bara de eroare = SD. Test t bilateral nepereche. *** P = 0,0002 (sec31-1) și ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imagine 3D a ERES-ului selectat cu încărcătura suprapusă (3) marcată în (C). Gas1-GFP (verde) și Mid2-iRFP (albastru) se apropie de ERES (magenta) din aceeași parte și rămân în aceeași zonă restricționată ERES. Bara de scală, 100 nm.
Acest studiu oferă dovezi directe in vivo că încărcăturile de proteine ​​lipidice sunt clasificate în situsuri de export selective în calea secretorie și dezvăluie importanța lungimii lanțului acil pentru selectivitatea clasificării. Folosind o tehnică de microscopie puternică și de ultimă generație numită SCLIM, am demonstrat recent sintetizarea Gas1-GFP (o GPI-AP majoră din membrana plasmatică cu o porțiune lipidică ceramidă cu lanț acil foarte lung (C26)) la drojdie. Regiunile grupate în RE discrete sunt asociate cu ERES specifice, în timp ce proteinele secretate transmembranar sunt distribuite în întreaga membrană a RE (Figura 1). În plus, aceste două tipuri de substanțe intră selectiv în ERES diferite (Figura 2). Lungimea lanțului acil al ceramidei celulare din membrană este redusă de la C26 la C18-C16, grupul Gas1-GFP este perturbat în regiunea RE discretă, iar Gas1-GFP este redirecționat pentru a părăsi RE cu proteina transmembranară prin același ERES (Figura 3 și Figura 3).4).
Deși GPI-AP utilizează un mecanism proteic specializat pentru a ieși din RE, am constatat că separarea dependentă de ceramidă C26 nu se bazează pe interacțiuni proteice diferențiale care ar putea duce la specializarea ERES (Figurile S4 și S5). În schimb, descoperirile noastre susțin un mecanism alternativ de clasificare, condus de gruparea proteinelor pe bază de lipide și excluderea ulterioară a altor încărcături. Observațiile noastre indică faptul că regiunea sau clusterul Gas1-GFP asociat cu un ERES specific nu are proteina secretată transmembranar Mid2-iRFP, ceea ce indică faptul că clusterul GPI-AP dependent de ceramidă C26 va facilita intrarea lor în ERES relevant și, în același timp, va exclude secrețiile transmembranare. Secrețiile intră în acest ERES particular (Figurile 1 și 2). În schimb, prezența ceramidelor C18-C16 în membrana RE nu determină GPI-AP să formeze regiuni sau clustere, deci acestea nu exclud sau înlocuiesc proteinele secretate transmembranar în același ERES (Figurile 3 și 4). Prin urmare, propunem ca ceramida C26 să conducă la separarea și clasificarea prin facilitarea grupării proteinelor legate de ERES specifice.
Cum se poate realiza această grupare dependentă de ceramidă C26 într-o zonă specifică a RE? Tendința ceramidei membranare de a se separa lateral poate determina GPI-AP și ceramida C26 să formeze lipide mici și ordonate instantaneu în mediul lipidic mai neregulat al membranei RE, care conține glicerolipide mai scurte și nesaturate. Clustere de calitate (17, 18). Aceste mici clustere temporare pot fi fuzionate în continuare în clustere mai mari și mai stabile după legarea la complexul p24 (34). În concordanță cu aceasta, am arătat că C26 Gas1-GFP trebuie să interacționeze cu complexul p24 pentru a forma clustere vizibile mai mari (Figura 3). Complexul p24 este un oligomer heterozigot compus din patru proteine ​​transmembranare p24 diferite în drojdie (35), care asigură o legare multivalentă, ceea ce poate duce la reticularea clusterelor mici de GPI-AP, generând astfel un cluster stabil mai mare (34). Interacțiunea dintre ectodomeniile proteice ale GPI-AP-urilor poate contribui, de asemenea, la agregarea lor, așa cum s-a demonstrat în timpul transportului lor prin Golgi în celulele epiteliale polarizate ale mamiferelor (36). Cu toate acestea, atunci când ceramida C18-C16 este prezentă în membrana RE, atunci când complexul p24 se leagă de Gas1-GFP, nu se vor forma clustere mari separate. Mecanismul care stă la baza acesteia poate depinde de proprietățile fizice și chimice specifice ale ceramidei cu lanț acil lung. Studiile biofizice ale membranelor artificiale arată că, deși atât ceramidele cu lanț acil lung (C24), cât și cele cu lanț acil scurt (C18-C16) pot provoca separarea fazelor, numai ceramidele cu lanț acil lung (C24) pot promova o curbură ridicată și îndoirea peliculei pentru a o remodela, prin referință reciprocă (17, 37, 38). S-a demonstrat că spirala transmembranară a TMED2, omologul uman al Emp24, interacționează selectiv cu sfingomielina pe bază de ceramidă C18 din lobulii citoplasmatici (39). Folosind simulări de dinamică moleculară (MD), am descoperit că atât ceramidele C18, cât și cele C26 se acumulează în jurul lobulilor citoplasmatici ai spiralei transmembranare Emp24 și au preferințe similare (Figura S6). Este demn de remarcat faptul că acest lucru indică faptul că spirala transmembranară a Emp24 poate duce la o distribuție asimetrică a lipidelor în membrană. Acesta este un rezultat recent bazat pe celule de mamifere. Simulări MD similare arată, de asemenea, prezența lipidelor eterice (40). Prin urmare, speculăm că ceramida C26 din cei doi lobuli ai ER26 este îmbogățită local. Când GPI-AP din lobulii luminali se leagă direct de p24 multivalent și acumularea de ceramidă C26 în jurul p24 în lobulii citoplasmatici, aceasta poate promova agregarea proteinelor și curbura membranei generate prin degete (41), determinând separarea GPI-AP în regiuni discrete adiacente ERES, ceea ce favorizează și regiunile puternic curbate ale membranei RE (42). Rapoartele anterioare au susținut mecanismul propus (43, 44). Legarea multivalentă a oligolectinelor, agenților patogeni sau anticorpilor la glicosfingolipidele (GSL) pe bază de ceramidă de pe membrana plasmatică declanșează o agregare mare a GSL, sporește separarea fazelor și provoacă deformarea și internalizarea membranei (44). Iwabuchi etc. (43) S-a constatat că, în prezența unor lanțuri acil lungi (C24), dar nu scurte (C16), ligandul multivalent legat de lactozilceramida GSL a indus formarea de clustere mari și invaginarea membranei, iar transducția semnalului mediată de Lyn în citoplasmă pe foițe este interdigitată de lanțuri acil în neutrofilele cuplate.
În celulele epiteliale polarizate ale mamiferelor, concentrația rețelei anti-Golgi (TGN) la nivelul membranei plasmatice apicale controlează separarea și sortarea GPI-AP (10, 45). Această agregare este determinată de oligomerizarea GPI-AP (36), dar poate depinde și de lungimea lanțului de ceramidă pe care îl găsim la drojdie. Deși GPI-AP la mamifere are o ancoră lipidică eterică, iar structura sa chimică este foarte diferită de ceramida cu lanț acil foarte lung, un studiu recent a descoperit că ambele lipide au proprietăți fizice și chimice și funcții evolutiv similare (40). Prin urmare, partea lipidică eterică din celulele mamiferelor poate fi similară cu ceramida C26 din drojdie, iar rolul său este de a se asocia cu ceramida cu lanț lung din membrană pentru a promova agregarea și sortarea GPI-AP. Deși această posibilitate trebuie încă testată direct, descoperirile anterioare susțin că transportul ceramidei cu lanț acil lung către corpul Golgi nu este efectuat de proteinele de transfer citoplasmatice, ci depinde de sinteza ancorelor GPI, precum drojdia. Prin urmare, mecanismul conservator evolutiv pare a fi capabil să co-transporte selectiv ceramidă cu lanț acil foarte lung și GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) în aceeași veziculă de transport.
În sistemele celulare epiteliale polarizate de drojdie și mamifere, agregarea și separarea GPI-AP de alte proteine ​​ale membranei plasmatice au loc înainte de a ajunge la suprafața celulară. Paladino și colab. (48) au descoperit că pe TGN al celulelor epiteliale polarizate de mamifere, gruparea GPI-AP nu este necesară doar pentru clasificarea selectivă a GPI-AP-urilor pe membrana plasmatică apicală, ci reglează și organizarea grupării GPI-AP-urilor și activitatea lor biologică. Suprafața celulară. La drojdie, acest studiu a arătat că gruparea GPI-AP dependentă de ceramidă C26 de pe RE poate regla organizarea grupării și activitatea funcțională a GPI-AP pe membrana plasmatică (24, 49). În concordanță cu acest model, celulele GhLag1 sunt alergice la inhibitorii GPI sau la medicamentele care afectează integritatea peretelui celular (28), iar necesitatea unor grupări Gas1-GFP funcționale (49) ale ceramidei de vârf proiectate în împerecherea celulelor de drojdie indică posibile consecințe fiziologice ale celulelor hLag1. Eroare GPI-AP. Cu toate acestea, testarea suplimentară a faptului dacă organizarea funcțională a suprafeței celulare a fost programată din RE printr-o metodă de sortare bazată pe lungimea lipidelor va face obiectul cercetărilor noastre viitoare.
Tulpinile de Saccharomyces cerevisiae utilizate în această lucrare sunt enumerate în Tabelul S1. Tulpinile MMY1583 și MMY1635 de SCLIM pentru imagistica celulelor vii au fost construite în fundalul W303. Aceste tulpini care exprimă Sec13-mCherry cu o etichetă proteică fluorescentă au fost construite utilizând o metodă bazată pe reacția în lanț a polimerazei (PCR) cu plasmida pFA6a ca șablon (23). Tulpina care exprimă Mid2-iRFP marcată cu proteina fluorescentă sub controlul promotorului GAL1 a fost construită după cum urmează. Amplificarea PCR a secvenței iRFP-KanMx din vectorul pKTiRFP-KAN (cadou de la E. O'Shea, plasmida Addgene numărul 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificator resursă de cercetare (RRID): Addgene_64687) și inserată în capătul C-terminal al Mid2 endogen. După ce secvența genomului Mid2-iRFP a fost amplificată și clonată în promotorul GAL1, aceasta a fost integrată în situsul Not I-Sac I al plasmidei de integrare pRS306. Plasmida rezultată pRGS7 a fost liniarizată cu Pst I pentru a se integra în locusul URA3.
Gena de fuziune Gas1-GFP este exprimată sub controlul promotorului GAL1 în plasmida centromerului (CEN), care este construită după cum urmează. Secvența Gas1-GFP a fost amplificată prin PCR din plasmida pRS416-GAS1-GFP (24) (cadou de la L. Popolo) și clonată în situsul Xma I–Xho I al plasmidei CEN pBEVY-GL LEU2 (cadou de la C). Miller; plasmidul Addgene numărul 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmida rezultată a fost denumită pRGS6. Gena de fuziune Axl2-GFP este, de asemenea, exprimată sub controlul promotorului GAL1 al vectorului pBEVY-GL LEU2, iar construcția sa este următoarea. Secvența Axl2-GFP a fost amplificată din plasmida pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) prin PCR și clonată în situsul Bam HI-Pst I al vectorului pBEVY-GL LEU2. Plasmida rezultată a fost denumită pRGS12. Secvența oligonucleotidelor utilizate în acest studiu este prezentată în Tabelul S2.
Tulpina a fost suplimentată cu 0,2% adenină și 2% glucoză [YP-dextroză (YPD)], 2% rafinoză [YP-rafinoză], mediu bogat în proteine ​​din extract de drojdie (YP) (1% extract de drojdie și 2% proteină (YPR)) sau 2% galactoză [YP-galactoză (YPG)] ca sursă de carbon, sau într-un mediu minimal sintetic (0,15% bază de azot de drojdie și 0,5% sulfat de amoniu) pentru a suplimenta aminoacizii și bazele necesare nutriției, și conținând 2% glucoză (mediu minimal sintetic cu glucoză) sau 2% galactoză (mediu minimal sintetic cu galactoză) ca sursă de carbon.
Pentru imagistica în timp real, celulele mutante sec31-1 sensibile la temperatură care exprimă constructul sub promotorul GAL1 au fost cultivate în mediu YPR la 24°C peste noapte până la faza logaritmică medie. După inducerea în YPG la 24°C timp de 1 oră, celulele au fost incubate în SG la 37°C timp de 30 de minute și apoi transferate la 24°C pentru a se elibera din blocul de secreție. Concanavalina A a fost utilizată pentru a fixa celulele pe o lamă de sticlă și imagistica a fost realizată prin SCLIM. SCLIM este o combinație între microscopul cu fluorescență inversată Olympus IX-71 și lentila cu ulei cu apertură numerică UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), un scaner confocal cu disc rotativ de mare viteză și cu raport semnal-zgomot ridicat (Yokogawa Electric), un spectrometru personalizat și un sistem de răcire personalizat. Intensificatorul de imagine al sistemului (Hamamatsu Photonics) poate oferi un sistem de lentile de mărire cu o mărire finală de ×266.7 și o cameră cu dispozitiv cuplat la sarcină care multiplică electronii (Hamamatsu Photonics) (21). Achiziția imaginilor este efectuată de un software personalizat (Yokogawa Electric). Pentru imaginile 3D, am folosit un actuator piezoelectric personalizat pentru a vibra lentila obiectiv pe verticală și am colectat părțile optice la o distanță de 100 nm într-o stivă. Imaginea Z-stack este convertită în date voxel 3D, iar funcția teoretică de dispersie a punctelor utilizată pentru microscopul confocal cu disc rotativ este utilizată pentru procesarea deconvoluției de către software-ul Volocity (PerkinElmer). Prin utilizarea software-ului Volocity pentru a stabili automat pragul pentru analiza de colocație, s-a măsurat ERES, inclusiv încărcătura. Analiza prin scanare liniară a fost efectuată folosind software-ul MetaMorph (Molecular Devices).
Se utilizează software-ul GraphPad Prism pentru a determina semnificația statistică. Pentru testul t Student bilateral și testul ANOVA (analiza varianței unidirecționale) obișnuit, se consideră că diferențele dintre grupuri au un impact semnificativ asupra valorii P < 0,05 (*).
Pentru microscopia cu fluorescență a Gas1-GFP, celulele din fază logaritmică au fost crescute peste noapte în YPD și colectate prin centrifugare, spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat și incubate pe gheață timp de cel puțin 15 minute, apoi examinate la microscop așa cum s-a descris anterior Verificare (24). Pentru achiziție s-a utilizat microscopul Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) echipat cu o lentilă obiectiv, filtru L5 (GFP), cameră Hamamatsu și software-ul Application Suite X (LAS X).
Probele au fost denaturate cu tampon SDS la 65°C timp de 10 minute, apoi separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă-SDS (PAGE). Pentru analiza imunoblotting, s-au încărcat 10 μl de probă pe bandă. Anticorp primar: S-a utilizat anti-Gas1 policlonal de iepure la o diluție de 1:3000, anti-Emp24 policlonal de iepure la o diluție de 1:500 și anti-GFP policlonal de iepure (cadou de la H. Riezman) la o diluție de 1:3000. Anticorpul monoclonal de șoarece anti-Pgk1 a fost utilizat la o diluție de 1:5000 (cadou de la J. de la Cruz). Anticorp secundar: Imunoglobulină G (IgG) de capră anti-iepure conjugată cu peroxidază de hrean (HRP) utilizată la o diluție de 1:3000 (Pierce). IgG de capră anti-șoarece conjugat cu HRP a fost utilizat la o diluție de 1:3000 (Pierce). Zona de răspuns imun a fost observată prin metoda chemiluminescenței cu reactivul SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Așa cum este descris în (31), s-a efectuat un experiment de imunoprecipitare naturală pe fracția ER îmbogățită. Pe scurt, celulele de drojdie s-au spălat cu tampon TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil și amestec de inhibitori de protează] la 600 nm (OD600) la o densitate optică de 100 de două ori. Acesta a fost spart cu sfere de sticlă, iar apoi resturile celulare și sferele de sticlă au fost îndepărtate prin centrifugare. Supernatantul a fost apoi centrifugat la 17.000 g timp de 15 minute la 4°C. Peleta a fost resuspendată în TNE și s-a adăugat saponină digitalică până la o concentrație finală de 1%. Suspensia a fost incubată timp de 1 oră cu rotație la 4°C, iar apoi componentele insolubile au fost îndepărtate prin centrifugare la 13.000 g la 4°C timp de 60 de minute. Pentru imunoprecipitarea Gas1-GFP, se preincubează mai întâi proba cu sfere de agaroză goale (ChromoTek) la 4°C timp de 1 oră, apoi se incubează cu GFP-Trap_A (ChromoTek) la 4°C timp de 3 ore. Sferele imunoprecipitate au fost spălate de cinci ori cu TNE conținând 0,2% digoxigenină, eluate cu tampon SDS pentru probe, separate pe SDS-PAGE și analizate prin imunoblotting.
Așa cum este descris în (31), determinarea reticulării a fost efectuată pe fracția ER îmbogățită. Pe scurt, fracția ER îmbogățită a fost incubată cu 0,5 mM ditiobis(succinimidil propionat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, SUA; 20°C, 20 min). Reacția de reticulare a fost stinsă prin adăugarea de glicină (concentrație finală 50 mM, 5 minute, 20°C).
Așa cum s-a descris anterior (50), s-a efectuat analiza MS a ceramidei în tulpinile de tip sălbatic și GhLag1. Pe scurt, celulele au fost crescute până la fază exponențială (3 până la 4 unități OD600/ml) în YPD la 30°C și au fost recoltate 25×107 celule. Metabolismul lor este stins cu acid tricloracetic. Se utilizează solvent de extracție [etanol, apă, eter, piridină și hidroxid de amoniu 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] și 1,2 nmol de ceramidă C17 standard intern (860517, Avanti polar lipid). Se utilizează reactiv de monometilamină [metanol, apă, n-butanol și soluție de metilamină (4:3:1:5 v/v)] pentru a efectua hidroliza alcalină ușoară a extractului, apoi se utilizează n-butanol saturat cu apă pentru desalinare. În final, extractul a fost resuspendat într-un solvent în mod pozitiv [cloroform/metanol/apă (2:7:1) + 5 mM acetat de amoniu] și injectat în spectrometrul de masă. Monitorizarea multi-reacție (MRM) a fost efectuată pentru identificarea și cuantificarea moleculelor de sfingolipide. Spectrometrul de masă cuadripol terțiar TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) este echipat cu o sursă robotică de ioni cu nanoflux Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) pentru analiza lipidelor. Energia de coliziune este optimizată pentru fiecare categorie de ceramidă. Datele MS au fost obținute în mod pozitiv. Pentru fiecare replică biologică, semnalul lipidic este mediana a trei măsurători independente.
Așa cum este descris în (31), celulele (800×107) care exprimă Gas1-GFP au fost supuse imunoprecipitării naturale. Gas1-GFP purificat a fost separat prin SDS-PAGE și transferat pe o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF). Proteina a fost vizualizată prin colorarea PVDF cu negru de amidă. Banda Gas1-GFP a fost tăiată din PVDF și spălată de 5 ori cu metanol și o dată cu apă de calitate cromatografie lichidă-MS (LC-MS). Prin incubarea benzii de membrană cu 500 μl de NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampon și 500 μl de amestec de nitrit de sodiu 1 M proaspăt dizolvat la 37°C timp de 3 ore, fracția lipidică este eliberată din Gas1-GFP și lizată între glucozamină și inozitol (51). După aceea, banda de membrană a fost spălată de patru ori cu apă de calitate LC-MS, uscată la temperatura camerei și depozitată într-o atmosferă de azot la -80°C până la analiză. Ca martor, s-a utilizat o probă martor de membrană PVDF pentru fiecare experiment. Lipida extrasă din Gas1-GFP a fost apoi analizată prin MS așa cum este descris (50). Pe scurt, benzile PVDF care conțineau GPI-lipidă au fost resuspendate în 75 μl de solvent negativ pentru matriță [cloroform/metanol (1:2) + 5 mM acetat de amoniu] și au fost supuse analizei prin ionizare prin electrospray (ESI)-MRM/MS a speciilor de sfingolipide (TSQ Vantage). În acest caz, datele MS au fost obținute în modul de ioni negativi.
Așa cum s-a menționat anterior, porțiunea lipidică a ancorei GPI a fost separată de GPI-AP marcat cu [3H]-inozitol (16). Lipidele au fost separate prin cromatografie în strat subțire folosind un sistem de solvent (55:45:10 cloroform-metanol-0,25% KCl) și vizualizate folosind FLA-7000 (Fujifilm).
Celulele care exprimă Gas1-GFP (600×107) au fost spălate de două ori cu tampon TNE și sparte cu perle de sticlă, apoi centrifugate pentru a îndepărta resturile celulare și perlele de sticlă. Supernatantul a fost apoi centrifugat la 17.000 g timp de 1 oră la 4°C. Peleta a fost spălată în TNE și incubată cu 1 U PI-PLC (Invitrogen) în TNE conținând 0,2% saponină digitalică timp de 1 oră la 37°C. După tratamentul enzimatic, membrana a fost îndepărtată prin centrifugare la 17.000 g la 4°C timp de 1 oră. Pentru imunoprecipitarea Gas1-GFP, supernatantul a fost incubat cu GFP-Trap_A (ChromoTek) la 4°C peste noapte. Gas1-GFP purificat, separat prin SDS-PAGE, a fost colorat cu albastru briliant Coomassie. Banda de colorare Gas1-GFP a fost separată de griul care înconjoară apeductul, iar după alchilare cu iodoacetamidă și reducere cu ditiotreitol, s-a efectuat digestia în gel cu tripsină. Se extrag și se usucă peptidele triptice și peptidele cu GPI-glicani. Peptida uscată a fost dizolvată în 20 μl de apă. Se injectează o porțiune (8 μl) în LC. O coloană de octadecilsilan (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diametru interior 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefectura Aichi, Japonia) a fost utilizată pentru a separa peptidele în condiții specifice de gradient. Faza mobilă este solventul A (0,08% acid formic) și solventul B (0,15% acid formic în 80% acetonitril). Un sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) a fost utilizat pentru a elua coloana cu solventul A în decurs de 55 de minute la un debit de 50 μl min-1 timp de 5 minute, apoi concentrația solventului B a fost crescută la 40%. , Statele Unite). Eluatul a fost introdus continuu în sursa de ioni ESI, iar peptidele triptice și peptidele cu GPI-glicani au fost analizate cu LTQ Orbitrap XL (spectrometru de masă hibrid liniar cu capcană de ioni-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). În configurația MS, tensiunea sursei capilare a fost setată la 4,5 kV, iar temperatura capilarului de transfer a fost menținută la 300°C. Tensiunea capilară și tensiunea lentilei tubului au fost setate la 15 V și, respectiv, 50 V. Datele MS au fost obținute în modul de ioni pozitivi (rezoluție de 60.000; precizie de masă de 10 părți per milion) într-un interval de masă de 300/m/z, raport masă/sarcină (m/z) 3000. Datele MS/MS sunt obținute prin intermediul capcanei de ioni din LTQ Orbitrap XL [primele 3 cifre de care depind datele, disociere indusă de coliziune (CID)].
Simulările MD au fost efectuate folosind software-ul GROMACS (52) și câmpul de forță MARTINI 2 (53-55). Instrumentul CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) a fost apoi utilizat pentru a construi un strat dublu care conține dioleoilfosfatidilcolină (DOPC) și Cer C18 sau DOPC și Cer C26. Topologia și coordonatele Cer C26 sunt derivate din DXCE prin eliminarea perlelor suplimentare din coada de sfingozină. Utilizați procesul descris mai jos pentru a echilibra stratul dublu și a-l rula, apoi utilizați ultimele coordonate ale sistemului pentru a construi un sistem care conține Emp24. Domeniul transmembranar al drojdiei Emp24 (reziduurile 173 până la 193) a fost construit ca o α-helix folosind structura moleculară a instrumentului vizual MD (VMD) (58). Apoi, după îndepărtarea lipidelor suprapuse, proteina a fost granulată grosier și inserată în stratul dublu folosind CHARMM GUI. Sistemul final conține 1202 DOPC și 302 Cer C26 sau 1197 DOPC și 295 Cer C18 și Emp24. Se ionizează sistemul la o concentrație de 0,150 M. Au fost realizate patru replici independente pentru două compoziții bistrat.
Bistratul lipidic este echilibrat folosind procesul CHARMM GUI, care implică minimizarea și apoi echilibrarea a 405.000 de pași, unde constrângerile de poziție sunt reduse și eliminate treptat, iar pasul de timp este crescut de la 0,005 ps la 0,02 ps. După echilibrare, produce 6 µs cu un pas de timp de 0,02 ps. După introducerea Emp24, utilizați același proces CHARMM GUI pentru a minimiza și echilibra sistemul, apoi rulați timp de 8 secunde în producție.
Pentru toate sistemele, în timpul procesului de echilibrare, presiunea este controlată de barostatul Berendsen (59), iar în timpul procesului de producție, presiunea este controlată de barostatul Parrinello-Rahman (60). În toate cazurile, presiunea medie este de 1 bar și se utilizează o schemă de cuplare a presiunii semi-izotrope. În procesul de echilibrare și producție, se utilizează un termostat (61) cu recalibrare a vitezei pentru a cupla temperatura particulelor de proteine, lipide și solvent, respectiv. Pe parcursul întregii operațiuni, temperatura țintă este de 310K. Interacțiunea fără legătură este calculată prin generarea unei liste de împerechere folosind schema Verlet cu o toleranță de tampon de 0,005. Termenul Coulomb este calculat folosind câmpul de reacție și o distanță de deviere de 1,1 nm. Termenul Vander Waals utilizează o schemă de deviere cu o distanță de deviere de 1,1 nm, iar schema de deviere Verlet este utilizată pentru deviația potențială (62).
Folosind VMD, lungimea de undă limită dintre perlele de fosfat DOPC sau perlele de ceramidă AM1 și proteină este de 0,7 nm, iar numărul de lipide care interacționează cu proteina este calculat. Conform următoarei formule, calculați factorul de epuizare-îmbogățire (DE) ca în (63): Factorul DE = (cantitatea de lipide totale din proteină 0,7) în proteină 0,7 (cantitatea de Cer din lipidele totale)
Valoarea raportată este obținută ca medie, iar barele de eroare reprezintă patru copii independente ale SE. Semnificația statistică a factorului DE este calculată prin testul t [(factor DE mediu - 1) / SE]. Se calculează valoarea P din distribuția unidirecțională.
Instrumentul GROMACS a fost utilizat pentru a calcula harta 2D a densității laterale a sistemului care conține Emp24 în ultimii 250 ns ai următorului element. Pentru a obține harta îmbogățirii/epuizării ceramidei, harta densității Cer este împărțită la suma dintre harta Cer și DOPC, apoi împărțită la concentrația de Cer din corp. Se utilizează aceeași scală de culoare a hărții.
Pentru materiale suplimentare pentru acest articol, vă rugăm să consultați http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Acesta este un articol cu ​​acces liber, distribuit în conformitate cu termenii Licenței Creative Commons Attribution-Non-Commercial, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea în orice mediu, atâta timp cât utilizarea finală nu este în scop comercial și premisa este că lucrarea originală este corectă. Referință.
Notă: Vă rugăm doar să ne furnizați adresa dvs. de e-mail, astfel încât persoana pe care o recomandați paginii să știe că doriți ca aceasta să vadă e-mailul și că nu este spam. Nu vom colecta nicio adresă de e-mail.
Această întrebare este folosită pentru a testa dacă sunteți vizitator și pentru a preveni trimiterea automată de spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Ar Miho Waga (Misko Lopez), Ar Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imagistica 3D de înaltă rezoluție în timp real relevă importanța lungimii lanțului de ceramidă pentru sortarea proteinelor în situsurile de ieșire selective.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Ar Miho Waga (Misko Lopez), Ar Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imagistica 3D de înaltă rezoluție în timp real relevă importanța lungimii lanțului de ceramidă pentru sortarea proteinelor în situsurile de ieșire selective.
©2020 Asociația Americană pentru Progresul Științei. Toate drepturile rezervate. AAAS este partener al HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef și COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.