Javascript este dezactivat în browserul dvs. Unele funcții ale acestui site web nu vor funcționa atunci când Javascript este dezactivat.
Înregistrează-te cu detaliile tale specifice și medicamentul specific de interes, iar noi vom potrivi informațiile pe care le furnizezi cu articolele din baza noastră de date extinsă și îți vom trimite imediat o copie PDF prin e-mail.
Granulele Ban-Lan-Gen atenuează colita cronică recidivantă indusă de dextran sulfat de sodiu la șoareci prin modularea microbiotei intestinale și restabilirea producției intestinale de SCFA Derived-GLP-1
Jiao Peng, 1-3, * Li Xi, 4, * Zheng Lin, 3, 5 Duan Lifang, 1 Gao Zhengxian, 2, 5 Diehu, 1 Li Jie, 6 Li Xiaofeng, 6 Shen Xiangchun, 5 Xiao Haitao21 Universitatea Peking, Spitalul din Shenzhen, Departamentul de Farmacie, Shenzhen, Republica Populară Chineză; 2 Centrul de Științe ale Sănătății al Universității Shenzhen, Facultatea de Farmacie, Shenzhen, Republica Populară Chineză; 3 Universitatea de Medicină Guizhou, Centrul de Cercetare Tehnologică Inginerească pentru Dezvoltarea și Aplicarea Medicinii Etnice și a Medicinii Tradiționale Chineze, Ministerul Educației, Laboratorul Cheie Provincial Guizhou de Farmacie, Universitatea de Medicină Guizhou, Guiyang, Republica Populară Chineză; 4 Departamentul de Gastroenterologie, Spitalul Universitar Peking Shenzhen, Shenzhen, Republica Populară Chineză; 5 Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicină Guizhou, Laboratorul Cheie de Stat pentru Funcția și Aplicarea Plantelor Medicinale, Guiyang; 6 Departamentul de Medicină de Laborator, Spitalul Universitar Peking Shenzhen, Shenzhen, China [email protected] Shen Xiangchun, Facultatea de Farmacie, Universitatea Medicală Guizhou, Guizhou, Republica Populară Chineză, 550004, Email [email protected] Obiectiv: Terapia pe bază de GLP-1 este o nouă opțiune de tratament pentru bolile inflamatorii intestinale. Granulele Ban-Lan-Gen (BLG) sunt o formulare antivirală cunoscută a MTC care prezintă o potențială activitate antiinflamatorie în tratamentul diferitelor afecțiuni inflamatorii. Cu toate acestea, efectul său antiinflamator asupra colitei și mecanismul său de acțiune sunt încă neclare. METODE: Pentru a stabili colita cronică recidivantă indusă de dextran sulfat de sodiu (DSS) la șoareci. Indicii de activitate a bolii, markerii histologici ai leziunii și nivelurile de citokine proinflamatorii au fost efectuați pentru a evalua efectul protector al BLG. Efectele BLG asupra microbiotei intestinale și a intestinului au fost caracterizate prin nivelurile serice de GLP-1 și expresia colonică a Gcg, GPR41 și GRP43, compoziția microbiotei intestinale, nivelurile de SCFA fecale și eliberarea de GLP-1 din intestinul primar. Producția de GLP-1 derivat din SCFA în celulele epiteliale colonice de șoarece. Rezultate: Tratamentul cu BLG a redus semnificativ pierderea în greutate corporală, DAI, scurtarea colonului, deteriorarea țesutului colonic și nivelurile de citokine proinflamatorii TNF-α, IL-1β și IL-6 în țesutul colonic. În plus, tratamentul cu BLG poate restabili semnificativ expresia colonică Gcg, GPR41 și GRP43 și nivelurile serice de GLP-1 la șoarecii cu colită și prin creșterea bacteriilor producătoare de SCFA, cum ar fi Akkermansia și Prevotellaceae_UCG-001, și reducerea abundenței bacteriilor precum Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas și Oscillibacter. În plus, tratamentul cu BLG poate crește semnificativ nivelul de SCFA în fecalele șoarecilor cu colită. În același timp, experimentele in vitro au arătat, de asemenea, că extractul fecal al șoarecilor tratați cu BLG poate stimula semnificativ secretarea de GLP-1 de către celulele epiteliale colonice murine mici primare. Concluzii: Aceste descoperiri sugerează că BLG are un efect anticolitic. BLG are potențialul de a fi dezvoltat ca terapie, cel puțin parțial prin modularea microbiotei intestinale și restabilirea producției intestinale de GLP-1 derivat din SCFA. Medicamente promițătoare pentru colita cronică recidivantă. Cuvinte cheie: colită, granule Ban-Lan-Gen, microbiotă intestinală, acizi grași cu lanț scurt, GLP-1.
Colita ulceroasă (CU) este o boală inflamatorie pe termen lung a colonului și rectului, caracterizată prin diaree recurentă, dureri abdominale, pierdere în greutate și scaune cu sânge mucopurulente.1 Recent, prevalența CU a crescut în țările cu incidență anterior scăzută, inclusiv China, odată cu creșterea popularității stilurilor de viață occidentale.2 Această creștere pune probleme majore pentru sănătatea publică și are implicații serioase asupra capacității pacienților de a munci și a calității vieții. În special, patogeneza CU rămâne în mare parte neclară, dar este în general acceptat faptul că genetica, factorii de mediu, microbiota intestinală și sistemul imunitar contribuie la dezvoltarea CU.3 Chiar și acum, nu există un leac pentru CU, iar scopul tratamentului este de a controla clinic simptomele clinice, de a induce și menține remisiunea, de a promova vindecarea mucoasei și de a reduce recurența. Tratamentele clasice includ aminosalicilați, corticosteroizi, imunosupresoare și produse biologice. Cu toate acestea, aceste medicamente nu pot obține efectul dorit din cauza diverselor lor efecte secundare.4 Recent, multe studii de caz au arătat că medicina tradițională chineză (MTC) a demonstrat un mare potențial în a ajuta pentru ameliorarea CU cu toxicitate redusă, sugerând că dezvoltarea de noi terapii MTC este o strategie promițătoare de tratament pentru CU.5-7
Granulele Banlangen (BLG) sunt un preparat din medicina tradițională chineză, obținut din extractul apos de rădăcină de Banlangen.8 Pe lângă eficacitatea sa antivirală, BLG prezintă o potențială activitate antiinflamatorie în tratamentul diferitelor afecțiuni inflamatorii.9,10 În plus, glucozinolații (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorubina și glucozida au fost izolați și identificați din extracte apoase de Radix isatidis) și nucleozide (hipoxantină, adenozină, uridină și guanozină) și alcaloizi indigo, cum ar fi indigo și indirubina.11,12 Studiile anterioare au documentat bine faptul că compușii adenozină, uridină și indirubină prezintă efecte anticolite puternice în diferite modele animale de colită.13-17 Cu toate acestea, nu au fost efectuate studii bazate pe dovezi pentru a evalua eficacitatea BLG în colită. În prezentul studiu, am investigat efectul protector al BLG asupra colitei cronice recidivante induse de dextran sulfat de sodiu (DSS) la șoareci C57BL/6 și am constatat că Administrarea orală de BLG a atenuat semnificativ inflamația colonului cronic recidivantă indusă de DSS la șoareci. Mecanismele sale de reglare sunt asociate cu modularea microbiotei intestinale și restabilirea producției de peptidă-1 asemănătoare glucagonului (GLP-1) derivată din intestin.
Granulele BLG (fără zahăr, aprobate de NMPA, Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Beijing, China; numărul lotului: 20110966) au fost achiziționate de la farmacii. DSS (greutate moleculară: 36.000–50.000 Daltoni) a fost achiziționat de la MP Biologicals (Santa Ana, SUA). Sulfasalazina (SASP) (puritate ≥ 98%), hematoxilina și eozina au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Kiturile de testare Elisa luminex pentru TNF-α, IL-1β și IL-6 de șoarece au fost achiziționate de la R&D systems (Minneapolis, MN, SUA). Acidul acetic, acidul propionic și acidul butiric au fost achiziționate de la Aladdin Industries (Shanghai, China). Acidul 2-etilbutiric a fost achiziționat de la Merck KGaA (Darmstadt, Germania).
Șoareci masculi C57BL/6 cu vârsta de 6-8 săptămâni (greutate corporală 18-22 g) au fost achiziționați de la Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China) și adăpostiți într-un mediu de 22 ± 2 °C cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă standard pentru rozătoare, cu acces liber la apă potabilă timp de o săptămână, pentru a se aclimatiza la noul mediu. Șoarecii au fost apoi împărțiți aleatoriu în patru grupe: grup de control, grup model DSS, grup tratat cu SASP (200 mg/kg, oral) și grup tratat cu BLG (1 g/kg, oral). După cum se arată în Figura 1A, conform studiului nostru anterior, colita cronică recidivantă experimentală a fost indusă la șoareci prin trei cicluri de DSS 1,8% timp de 5 zile, urmate de apă distilată timp de 7 zile, conform studiului nostru anterior. 18 Șoareci din grupurile tratate cu SASP și BLG au fost tratați cu SASP și respectiv BLG, în fiecare zi, începând cu ziua 0. Conform experimentelor preliminare, doza de Doza de BLG a fost stabilită la 1 g/kg. Între timp, doza de SASP a fost stabilită la 200 mg/kg, conform literaturii de specialitate.4 Grupurile de control și modelul DSS au primit același volum de apă pe tot parcursul experimentului.
Figura 1 BLG ameliorează colita cronică recidivantă indusă de DSS la șoareci. (A) Design experimental al colitei cronice recurente și tratament, (B) modificarea greutății corporale, (C) scorul indicelui de activitate a bolii (DAI), (D) lungimea colonului, (E) imagine reprezentativă a colonului, (F) colorare H&E a colonului (mărire, ×100) și (G) scor histologic. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 sau ###p < 0,001 față de grupul de control (Con); *p < 0,05 sau **p < 0,01 sau ***p < 0,001 față de grupul DSS.
Greutatea corporală, consistența scaunului și sângerarea rectală au fost înregistrate zilnic. Indicele de activitate a bolii (DAI) a fost determinat prin combinarea scorurilor de greutate corporală, consistență scaunului și sângerare rectală, așa cum s-a descris anterior.19 La sfârșitul experimentului, toți șoarecii au fost eutanasiați și s-au colectat sânge, fecale și colon pentru experimente ulterioare.
Țesutul de colon a fost fixat cu formalină și inclus în parafină. Au fost realizate secțiuni de 5 microni și colorate cu hematoxilină-eozină (H&E), apoi au fost ignorate și evaluate conform descrierii anterioare.19
ARN-ul total din țesutul de colon a fost extras cu reactivul Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), urmat de extracția ADNc cu transcriptază inversă (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japonia). PCR cantitativă a fost efectuată utilizând un sistem PCR în timp real cu SYBR Green Master (Roche, Basel, Elveția). Transcrierile genei țintă au fost normalizate la β-actină, iar datele au fost analizate utilizând metoda 2-ΔΔCT. Secvențele primerilor genetici sunt prezentate în Tabelul 1.
Izolarea și cultura primară a celulelor epiteliale colonice de șoarece au fost efectuate așa cum s-a descris anterior.20 Pe scurt, colonul șoarecilor cu vârsta cuprinsă între 6 și 8 săptămâni a fost mai întâi excizat după sacrificare prin dislocare cervicală, apoi deschis longitudinal, tratat cu soluție salină echilibrată Hanks (HBSS, fără calciu și magneziu) și tăiat în bucăți mici de 0,5-1 mm. Ulterior, țesuturile au fost digerate cu 0,4 mg/ml colagenază XI (Sigma, Poole, Marea Britanie) în mediu DMEM liber și centrifugate la 300 xg timp de 5 minute la temperatura camerei. Resuspendați peleta în mediu DMEM (suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 100 unități/ml penicilină și 100 µg/ml streptomicină) la 37 °C și treceți printr-o plasă de nailon (dimensiunea porilor ~250 µm). Alicote de celule epiteliale colonice au fost plasate în vase cu fund de sticlă și incubate cu acid acetic, acid propionic, acid butiric și extracte fecale de șoarece pentru 2 ore la 37°C, 5% CO2.
Țesutul de colon a fost omogenizat cu PBS, iar nivelurile de citokine IL-6, TNF-α și IL-1β din țesutul de colon au fost detectate utilizând kituri de testare ELISA luminex (R&D systems, Minneapolis, MN, SUA). De asemenea, nivelurile de GLP-1 din ser și mediul de cultură al celulelor epiteliale colonice murine primare au fost determinate cu un kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, China), conform instrucțiunilor producătorului.
ADN-ul total din fecale a fost extras folosind un kit de extracție ADN (Tiangen, China). Calitatea și cantitatea ADN-ului au fost măsurate la raporturile de 260 nm/280 nm și respectiv 260 nm/230 nm. Ulterior, folosind fiecare ADN extras ca șablon, s-au utilizat primeri specifici 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) și 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) pentru a amplifica regiunile V3-V4 ale genei ARNr 16S în diferite regiuni. Produsele PCR au fost purificate folosind kitul de extracție pe gel QIAquick (QIAGEN, Germania), cuantificate prin PCR în timp real și secvențiate folosind platforma de secvențiere IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, SUA). Pentru analiza bioinformatică, procesarea datelor a fost efectuată urmând protocoalele raportate anterior.21,22 Pe scurt, utilizați Cutadapt (V1.9.1) pentru a filtra fișierele expres brute. OTU-urile au fost grupate folosind UPARSE. (versiunea 7.0.1001) cu o limită de similaritate de 97%, iar UCHIME a fost utilizat pentru a elimina secvențele himerice. Analiza compoziției comunității și clasificarea au fost efectuate utilizând clasificatorul RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) bazat pe baza de date a genelor ARN ribozomal SILVA.
Nivelurile de acizi grași cu lanț scurt (acid acetic, acid propionic și acid butiric) au fost măsurate așa cum s-a descris anterior de Tao și colab., cu unele modificări.23 Pe scurt, 100 mg de fecale au fost suspendate mai întâi în 0,4 ml de apă deionizată, urmate de 0,1 ml de acid sulfuric 50% și 0,5 ml de acid 2-etilbutiric (standard intern), apoi omogenizate și încălzite la 4°C. Centrifugați la 12.000 rpm timp de 15 minute la C. Supernatantul a fost extras cu 0,5 mL de eter și injectat în GC pentru analiză. Pentru analiza prin cromatografie gazoasă (GC), probele au fost analizate utilizând un cromatograf de gaz GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) echipat cu un detector de ionizare în flacără (FID). Separarea a fost realizată utilizând o coloană ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., China). Datele au fost obținute utilizând software-ul pentru soluții GC (Shimadzu, Inc.). Raportul de divizare a fost de 10:1, gazul purtător a fost azot, iar debitul a fost de 6 mL/min. Volumul injectat a fost de 1 μL. Temperatura injectorului și a detectorului a fost de 300°C. Temperatura cuptorului a fost menținută la 140°C timp de 13,5 minute, apoi crescută la 250°C cu o viteză de 120°C/min; temperatura a fost menținută timp de 5 minute.
Datele sunt prezentate ca medie ± eroarea standard a mediei (SEM). Semnificația datelor a fost evaluată prin ANOVA cu o singură direcție, urmată de testul Duncan cu intervale multiple. Software-ul GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, SUA) a fost utilizat pentru toate calculele, iar o valoare p < 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.
Este bine cunoscut faptul că CU este o boală colită cronică recidivantă, cu dureri abdominale severe, diaree și sângerări. Prin urmare, a fost stabilită colita cronică recidivantă indusă de DSS la șoareci pentru a evalua eficacitatea anticolitică a BLG (Fig. 1A). Comparativ cu grupul de control, șoarecii din grupul model DSS au avut o greutate corporală semnificativ redusă și un DAI mai mare, iar aceste modificări au fost semnificativ inversate după 24 de zile de tratament cu BLG (Figura 1B și C). Scurtarea colonului este o caracteristică importantă a CU. După cum se arată în Figurile 1D și E, lungimile colonului șoarecilor care au primit DSS au fost semnificativ scurtate, dar au fost ameliorate prin tratamentul cu BLG. Ulterior, s-a efectuat o analiză histopatologică pentru a evalua inflamația colonică. Imaginile colorate cu H&E și scorurile patologice au arătat că administrarea de DSS a perturbat semnificativ arhitectura colonului și a dus la distrugerea criptelor, în timp ce tratamentul cu BLG a redus semnificativ distrugerea criptelor și scorurile patologice (Figura 1F și G). În mod notabil, efectul protector al BLG la o doză de 1 g/kg a fost comparabil cu cel al SASP la o doză de 200 mg/kg. Împreună, aceste descoperiri sugerează că BLG este eficient în reducerea severității colitei cronice recidivante induse de DSS la șoareci.
TNF-α, IL-1β și IL-6 sunt markeri inflamatori importanți ai inflamației colonice. După cum se arată în Figura 2A, DSS a indus o creștere semnificativă a expresiei genice a TNF-α, IL-1β și IL-6 în colon, comparativ cu grupul de control. Administrarea de BLG poate inversa semnificativ aceste modificări mediate de DSS. Apoi, am utilizat testul ELISA pentru a determina nivelurile citokinelor inflamatorii TNF-α, IL-1β și IL-6 în țesutul colonic. Rezultatele au arătat, de asemenea, că nivelurile colonice de TNF-α, IL-1β și IL-6 au fost semnificativ crescute la șoarecii tratați cu DSS, în timp ce tratamentul cu BLG a atenuat aceste creșteri (Figura 2B).
Figura 2 BLG inhibă expresia genelor și producerea citokinelor proinflamatorii TNF-α, IL-1β și IL-6 în colonul șoarecilor tratați cu DSS. (A) Expresia genelor colonice ale TNF-α, IL-1β și IL-6; (B) Nivelurile proteinelor colonice ale TNF-α, IL-1β și IL-6. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 sau ##p < 0,01 sau ###p < 0,001 față de grupul de control (Con); *p < 0,05 sau **p < 0,01 față de grupul DSS.
Disbioza intestinală este critică în patogeneza colitei reumatoide (CU).24 Pentru a investiga dacă BLG modulează microbiota intestinală a șoarecilor tratați cu DSS, s-a efectuat secvențierea ARNr 16S pentru a analiza comunitatea bacteriană a conținutului intestinal. Diagrama Venn arată că cele trei grupuri au în comun 385 de OTU-uri. În același timp, fiecare grup a avut OTU-uri unice (Fig. 3A). În plus, indicele Chao1 și indicele Shannon prezentate în Figura 3B și C au arătat că diversitatea comunității microbiotei intestinale a fost redusă la șoarecii tratați cu BLG, deoarece indicele Shannon a fost semnificativ scăzut în grupul tratat cu BLG. Analiza componentelor principale (PCA) și analiza coordonatelor principale (PCoA) au fost utilizate pentru a determina modelele de grupare între cele trei grupuri și au arătat că structura comunității șoarecilor tratați cu DSS a fost clar separată după tratamentul cu BLG (Figura 3D și E). Aceste date sugerează că tratamentul cu BLG a afectat semnificativ structura comunității șoarecilor cu colită indusă de DSS.
Figura 3 BLG modifică diversitatea microbiotei intestinale la șoarecii cu colită indusă de DSS. (A) Diagrama Venn a OTU, (B) Indicele Chao1, (C) Indicele de bogăție Shannon, (D) Graficul scorului Analizei în Componente Principale (PCA) al OTU, (E) Scorul Analizei în Coordonate Principale OTU (PCoA) (Figură). Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 6). **p < 0,01 față de grupul DSS.
Pentru a evalua modificările specifice ale microbiotei fecale, am analizat compoziția microbiotei intestinale la toate nivelurile taxonomice. După cum se arată în Figura 4A, principalele încrengături din toate grupurile au fost Firmicutes și Bacteroidetes, urmate de Verrucomicrobia. Abundențele relative ale Firmicutes și raporturile Firmicutes/Bacteroidetes au fost semnificativ crescute în comunitățile microbiene fecale ale șoarecilor tratați cu DSS comparativ cu șoarecii de control, iar aceste modificări au fost semnificativ inversate după tratamentul cu BLG. În special, tratamentul cu BLG a crescut semnificativ abundența relativă a Verrucobacterium în fecalele șoarecilor cu colită indusă de DSS. La nivel de gospodărie, comunitățile microbiene fecale au fost ocupate de Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae și Prevotellaceae (Fig. 4B). Comparativ cu grupul DSS, epuizarea BLG a crescut abundența Akkermansiaceae, dar a scăzut abundența Lachnospiraceae și Ruminococcaceae. În special, la nivel de gen, comunitățile fecale... Microbiota a fost ocupată de Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia și Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Această constatare a demonstrat, de asemenea, că tratamentul cu BLG a inversat eficient dezechilibrul microbiotei ca răspuns la provocarea cu DSS, caracterizat printr-o scădere a Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas și Oscillibacter și o creștere a Akkermansia și Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4 BLG modifică abundența microbiotei intestinale la șoarecii cu colită indusă de DSS. (A) Abundența microbiotei intestinale la nivel de încrengătură; (B) Abundența microbiotei intestinale la nivel de familie; (C) Abundența microbiotei intestinale la nivel de gen. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 6). #p < 0,05 sau ###p < 0,001 față de grupul de control (Con); *p < 0,05 sau **p < 0,01 sau ***p < 0,001 față de grupul DSS.
Având în vedere că acizii grași cu lanț scurt (AGCS) sunt principalii metaboliți ai Akkermansiei și Prevotellaceae_UCG-001, în timp ce acetatul, propionatul și butiratul sunt cei mai abundenți AGCS din lumenul intestinal,25-27 suntem încă în studiul nostru. După cum se arată în Figura 5, concentrațiile de acetat, propionat și butirat fecal au fost semnificativ reduse în grupul tratat cu DSS, în timp ce tratamentul cu BLG a putut suprima în mare măsură această reducere.
Figura 5. BLG crește nivelurile de SCFA în fecalele șoarecilor cu colită indusă de DSS. (A) Conținut de acid acetic în fecale; (B) conținut de acid propionic în fecale; (C) conținut de acid butiric în fecale. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 6). #p < 0,05 sau ##p < 0,01 față de grupul de control (Con); *p < 0,05 sau **p < 0,01 față de grupul DSS.
Am calculat în continuare coeficientul de corelație Pearson între SCFA diferențiale la nivel de gen și microbiota fecală. După cum se arată în Figura 6, Akkermansia a fost corelată pozitiv cu producția de acid propionic (Pearson = 0,4866) și acid butiric (Pearson = 0,6192). În schimb, atât Enteromonas, cât și Oscillobacter au fost asociate negativ cu producția de acetat, cu coeficienți Pearson de 0,4709 și, respectiv, 0,5104. În mod similar, Ruminococcaceae_UCG-014 a fost corelată negativ cu producția de acid propionic (Pearson = 0,4508) și, respectiv, acid butiric (Pearson = 0,5842).
Figura 6 Analiza corelației Pearson între SCFA diferențiale și microbii colonici. (A) Enteromonas cu acid acetic; (B) Bacil de comoție cerebrală cu acid acetic; (C) Akkermansia vs. acid propionic; (D) Ruminococcus_UCG-014 cu acid propionic; (E) Akkermansia cu acid butiric; (F) Ruminococcus_UCG-014 cu acid butiric.
Peptida-1 asemănătoare glucagonului (GLP-1) este un produs post-translațional specific tipului celular al proglucagonului (Gcg) cu proprietăți antiinflamatorii.28 După cum se arată în Figura 7, DSS a indus o scădere semnificativă a expresiei ARNm a Gcg. Tratamentul cu colon și BLG ar putea inversa semnificativ reducerea Gcg indusă de DSS în comparație cu grupul de control (Fig. 7A). În același timp, nivelul de GLP-1 din ser a fost redus semnificativ în grupul tratat cu DSS, iar tratamentul cu BLG ar putea preveni în mare măsură această reducere (Fig. 7B). Deoarece acizii grași cu lanț scurt pot stimula secreția de GLP-1 prin activarea receptorului 43 cuplat cu proteina G (GRP43) și a receptorului 41 cuplat cu proteina G (GRP41), am examinat, de asemenea, GPR41 și GRP43 în colonul șoarecilor cu colită și am constatat că expresia ARNm a GRP43 și GPR41 la nivel colonic a fost semnificativ scăzută după provocarea cu DSS, iar tratamentul cu BLG ar putea salva eficient aceste scăderi (Figura 7C și D).
Figura 7 BLG crește nivelurile serice de GLP-1 și expresia ARNm a Gcg, GPR41 și GRP43 la nivelul colonului la șoarecii tratați cu DSS. (A) Expresia ARNm a Gcg în țesutul colonului; (B) Nivelul GLP-1 în ser; (C) Expresia ARNm a GPR41 în țesutul colonului; (D) Expresia ARNm a GPR43 în țesutul colonului. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 sau ##p < 0,01 față de grupul de control (Con); *p < 0,05 față de grupul DSS.
Întrucât tratamentul cu BLG ar putea crește nivelurile serice de GLP-1, expresia ARNm a colonului Gcg și nivelurile de SCFA fecale la șoarecii tratați cu DSS, am examinat în continuare acetatul, propionatul și butiratul, precum și de la șoarecii de control (F-Con), DSS colită (F-Con) -DSS) și tratați cu BLG colită (F-BLG) asupra eliberării de GLP-1 din celulele epiteliale colonice murine primare. După cum se arată în Figura 8A, celulele epiteliale colonice murine primare tratate cu 2 mM acid acetic, acid propionic și respectiv acid butiric au stimulat semnificativ eliberarea de GLP-1, în concordanță cu studiile anterioare.29,30 De asemenea, toate F-Con, F-DSS și F-BLG (echivalentul a 0,25 g de fecale) au stimulat semnificativ eliberarea de GLP-1 din celulele epiteliale colonice murine primare. În special, cantitatea de GLP-1 eliberată de celulele epiteliale colonice murine primare tratate cu F-DSS a fost mult mai mică decât cea a celulelor epiteliale colonice murine primare tratate cu F-Con și F-BLG. celule epiteliale colonice de șoarece (Figura 8B). Aceste date sugerează că tratamentul cu BLG a restabilit semnificativ producția intestinală de GLP-1 derivată din SCFA.
Figura 8 SCFA derivat din BLG stimulează eliberarea de GLP-1 din celulele epiteliale colonice murine primare. (A) Acidul acetic, acidul propionic și acidul butiric au stimulat eliberarea de GLP-1 din celulele epiteliale colonice murine primare; (B) extractele fecale F-Con, F-DSS și F-BLG au stimulat celulele epiteliale colonice murine primare. Cantitatea de GLP-1 eliberată. Alicote de celule epiteliale colonice au fost plasate în vase Petri cu fund de sticlă și tratate cu 2 mM acid acetic, acid propionic, acid butiric și extracte fecale F-Con, F-DSS și F-BLG (echivalentul a 0,25 g fecale), respectiv. 2 ore la 37°C, respectiv 5% CO2. Cantitatea de GLP-1 eliberată din celulele epiteliale colonice murine primare a fost detectată prin ELISA. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM (n = 3). #p < 0,05 sau ##p < 0,01 față de blank sau F-Con; *p < 0,05 față de F-DSS.
Abrevieri: Ace, acid acetic; Pro, acid propionic; totuși, acid butiric; F-Con, extract fecal de la șoareci de control; F-DSS, extract fecal de la șoareci cu colită; F-BLG, din colon tratat cu BLG. Extracte fecale de la șoareci cu boli inflamatorii.
Listată de Organizația Mondială a Sănătății drept boală refractară, CU devine un pericol global; Cu toate acestea, metodele eficiente pentru prezicerea, prevenirea și tratarea bolii sunt încă limitate. Prin urmare, există o nevoie urgentă de a explora și dezvolta noi strategii terapeutice sigure și eficiente pentru CU. Preparatele din medicina tradițională chineză reprezintă o opțiune promițătoare, deoarece multe preparate din medicina tradițională chineză s-au dovedit a fi eficiente în tratamentul CU în populația chineză de-a lungul secolelor și sunt toate substanțe organice biologice și materiale naturale care sunt în mare parte inofensive pentru oameni și animale.31,32 Acest studiu a avut ca scop căutarea unui preparat din medicina tradițională chineză sigur și eficient pentru tratamentul CU și explorarea mecanismului său de acțiune. BLG este o formulă chineză pe bază de plante bine-cunoscută, utilizată pentru tratarea gripei.8,33 Lucrările din laboratorul nostru și al altora au arătat că indigo, un produs procesat din medicina tradițională chineză din aceeași materie primă ca BLG, prezintă o eficacitate semnificativă în tratamentul CU la oameni și animale.4,34 Cu toate acestea, efectele anticolite ale BLG și efectele sale Mecanismul este neclar. În studiul actual, rezultatele noastre demonstrează că BLG atenuează eficient inflamația colonică indusă de DSS, care este asociată cu modularea microbiotei intestinale și restabilirea producției de GLP-1 derivat din intestin.
Este bine cunoscut faptul că CU este caracterizată prin perioade recidivante cu caracteristici clinice tipice, cum ar fi pierderea în greutate, diareea, sângerările rectale și leziunile extinse ale mucoasei colonului.35 Astfel, colita cronică recidivantă a fost administrată prin administrarea a trei cicluri de DSS 1,8% timp de cinci zile, urmate de șapte zile de băut apă. După cum se arată în Figura 1B, pierderea fluctuantă în greutate și scorurile DAI au indicat inducerea cu succes a colitei cronice recidivante. Șoarecii din grupul tratat cu BLG au prezentat o recuperare ascendentă din ziua 8, semnificativ diferită de ziua 24. Aceleași modificări au fost observate și în scorul DAI, sugerând o îmbunătățire a ameliorării clinice a colitei. În ceea ce privește leziunile colonului și starea inflamatorie, lungimea colonului, afectarea țesutului colonului, expresia genelor și producerea citokinelor proinflamatorii TNF-α, IL-1β și IL-6 în țesutul colonului au fost, de asemenea, mult îmbunătățite după tratamentul cu BLG. Colectiv, aceste rezultate demonstrează clar că BLG este eficient în tratamentul colitei cronice recidivante la șoareci.
Cum își exercită BLG efectele farmacologice? Numeroase studii anterioare au arătat că microbiota intestinală joacă un rol cheie în patogeneza CU, iar terapiile bazate pe microbiom și cele țintite asupra microbiomului au apărut ca o strategie foarte atractivă pentru tratamentul CU. În prezentul studiu, am demonstrat că tratamentul cu BLG a dus la modificări semnificative ale compoziției microbiotei intestinale, sugerând că efectul protector al BLG împotriva colitei induse de DSS este legat de modularea microbiotei intestinale. Această observație este în concordanță cu ideea că reprogramarea homeostaziei microbiotei intestinale este o abordare importantă pentru înțelegerea eficacității preparatelor TCM.36,37 În special, Akkermansia este o bacterie Gram-negativă și strict anaerobă care trăiește în stratul de mucus al intestinului, care degradează mucinele, produce acid propionic, stimulează diferențierea celulelor caliciforme și menține funcția mucoasei de integritate a barierei.26 Date clinice multiple și pe animale sugerează că Akkermansia este strâns asociată cu mucoasa sănătoasă,38 iar administrarea orală de Akkermansia spp. poate îmbunătăți semnificativ inflamația mucoasei.39 Datele noastre actuale sugerează că abundența relativă a Akkermansia este semnificativ crescută după tratamentul cu BLG. În plus, Prevotellaceae_UCG-001 este o bacterie producătoare de SCFA.27 Studii multiple au arătat că Prevotellaceae_UCG-001 a fost găsită într-o abundență relativă scăzută în fecalele animalelor cu colită.40,41 Datele noastre actuale arată, de asemenea, că tratamentul cu BLG poate crește semnificativ abundența relativă a Prevotellaceae_UCG-001 în colonul șoarecilor tratați cu DSS. În schimb, Oscillibacter este o bacterie mezofilă, strict anaerobă.42 a raportat că abundența relativă a Oscillibacter a fost semnificativ crescută la șoarecii cu UC și a fost corelată pozitiv semnificativ cu nivelurile de IL-6 și IL-1β și scorurile patologice.43,44 În special, tratamentul cu BLG a redus semnificativ abundența relativă a Oscillibacter în fecalele șoarecilor tratați cu DSS. În special, aceste bacterii modificate cu BLG au fost cele mai producătoare de SCFA. Numeroase studii anterioare au demonstrat potențialul benefic efectele SCFA asupra inflamației colonului și protecției integrității epiteliale intestinale.45,46 Datele noastre actuale au observat, de asemenea, că concentrațiile de acetat, propionat și butirat de SCFA în fecalele tratate cu DSS au fost mult crescute la șoarecii tratați cu BLG. Luate împreună, aceste descoperiri demonstrează clar că tratamentul cu BLG poate spori eficient bacteriile producătoare de SCFA induse de DSS la șoarecii cu colită cronică recidivantă.
GLP-1 este o incretină produsă în principal în ileon și colon și joacă un rol important în întârzierea golirii gastrice și scăderea glicemiei postprandiale.47 Dovezile sugerează că dipeptidil peptidaza (DPP)-4, un agonist al receptorului GLP-1 și un nanomedicament GLP-1 pot atenua eficient inflamația intestinală la șoareci.48-51 După cum s-a raportat în studiile anterioare, concentrațiile ridicate de SCFA au fost asociate cu nivelurile plasmatice de GLP-1 la oameni și șoareci. 52 Datele noastre actuale arată că, după tratamentul cu BLG, nivelurile serice de GLP-1 și expresia ARNm Gcg au fost semnificativ crescute. De asemenea, secreția de GLP-1 a fost semnificativ crescută în culturile colonice după stimularea cu extracte fecale de la șoareci cu colită tratați cu BLG, comparativ cu stimularea cu extracte fecale de la șoareci cu colită tratați cu DSS. Cum afectează SCFA eliberarea de GLP-1? Gwen Tolhurst și colab. a raportat că SCFA poate stimula secreția de GLP-1 prin GRP43 și GPR41.29 Datele noastre actuale arată, de asemenea, că tratamentul cu BLG crește semnificativ expresia ARNm a GRP43 și GPR41 în colonul șoarecilor tratați cu DSS. Aceste date sugerează că tratamentul cu BLG poate restabili producția de GLP-1 promovată de SCFA prin activarea GRP43 și GPR41.
BLG este un medicament fără prescripție medicală (OTC) pe termen lung în China. Doza maximă tolerată de BLG la șoarecii Kunming este de 80 g/kg și nu s-a observat nicio toxicitate acută.53 În prezent, doza recomandată de BLG (fără zahăr) la om este de 9-15 g/zi (de 3 ori pe zi). Studiul nostru a arătat că BLG la 1 g/kg a ameliorat colita cronică recidivantă indusă de DSS la șoareci. Această doză este apropiată de doza de BLG utilizată clinic. Studiul nostru a constatat, de asemenea, că mecanismul său de acțiune este mediat, cel puțin parțial, de modificări ale microbiotei intestinale, în special de bacteriile producătoare de SCFA, cum ar fi Akkermansia și Prevotellaceae_UCG-001, pentru a restabili producția de GLP-1 derivată din intestin. Aceste descoperiri sugerează că BLG merită o atenție suplimentară ca agent terapeutic potențial pentru tratamentul clinic al colitei. Cu toate acestea, mecanismul exact prin care modulează microbiota intestinală rămâne de confirmat prin șoareci cu deficit de microbiotă și transplant de bacterii fecale.
As, acid acetic; but, acid butiric; BLG, pandan; DSS, dextran sulfat de sodiu; DAI, indice de activitate a bolii; DPP, dipeptidil peptidază; FID, detector de ionizare cu flacără; F-Con, control. Extracte fecale de șoareci; F-DSS, extracte fecale de șoareci cu colită DSS; F-BLG, extracte fecale de șoareci cu colită tratați cu BLG; GLP-1, peptidă-1 asemănătoare glucagonului; Gcg, glucagon; cromatografie gazoasă, cromatografie gazoasă; GRP43, receptor 43 cuplat cu proteina G; GRP41, receptor 41 cuplat cu proteina G; H&E, hematoxilină-eozină; HBSS, soluție salină echilibrată Hanks; OTC, OTC; PCA, analiza componentelor principale; PCoA, analiza coordonatelor principale; Pro, acid propionic; SASP, sulfasalazină; SCFA, acizi grași cu lanț scurt; medicină chineză, medicină tradițională chineză; CU, colită ulcerativă.
Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul de Etică Animală al Centrului Medical al Universității de Știință și Tehnologie Shenzhen-Hong Kong din cadrul Universității din Peking (Shenzhen, China), conform Orientărilor Instituționale și Regulamentului privind Animalele (numărul de etică A2020157).
Toți autorii au adus contribuții semnificative la concepție și design, achiziția de date sau analiza și interpretarea datelor; au participat la redactarea articolului sau la revizuirea critică a conținutului intelectual important; au fost de acord să trimită manuscrisul la revista curentă; au aprobat în final versiunea pentru publicare; au fost responsabili pentru toate aspectele lucrării.
Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională de Științe Naturale din China (81560676 și 81660479), proiectul de primă clasă al Universității Shenzhen (86000000210), Fondul Comitetului pentru Știință și Inovație Tehnologică din Shenzhen (JCYJ20210324093810026), Fondul de Cercetare în Știință și Tehnologie Medicală al Provinciei Guangdong (A2020157 și A2020272), Farmacia Universității de Medicină Guizhou din provincia Guizhou, finanțată de Key Laboratory (YWZJ2020-01) și Spitalul Universitar Peking Shenzhen (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, și alții. Potențialul terapeutic al triptolidei ca agent antiinflamator în colita experimentală indusă de dextran sulfat de sodiu la șoareci. pre-immune. 2020;11:592084. doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Povara globală a bolilor inflamatorii intestinale: din 2015 până în 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue și colab. Alcaloizi derivați din plante: modificatori promițători ai bolii în bolile inflamatorii intestinale. Prepharmacology. 2019;10:351. doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B și colab. Indigo Naturalis inhibă stresul oxidativ colonic și răspunsurile Th1/Th17 în colita indusă de DSS la șoareci. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Eficacitatea și siguranța Sophora flavescens (Sophora flavescens) din medicina chineză pe bază de plante în tratamentul colitei ulcerative: dovezi clinice și mecanisme potențiale. Prepharmacology. 2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Produse naturale: medicamente eficiente experimental pentru tratamentul bolilor inflamatorii intestinale. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Reflecții asupra tratamentului adjuvant al colitei ulcerative cu medicina tradițională chineză. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT și colab. Eficacitatea și siguranța granulelor Banlangen în tratamentul gripei sezoniere: un protocol de studiu pentru un studiu clinic randomizat controlat. trial. 2015;16:126. doi: 10.1186/s13063-015-0645-x