Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom afișa site-ul fără stiluri și JavaScript.
Spre deosebire de vertebrate, se crede că insectele nu au hormoni steroizi sexuali cu preponderență masculină. La Anopheles gambiae, steroidul ecdizonic 20-hidroxiecdizonă (20E) pare să fi evoluat pentru a controla dezvoltarea ouălor atunci când este sintetizat de femele2 și pentru a induce o perioadă refractară la împerechere atunci când este transferat sexual de către masculi3. Deoarece dezvoltarea și împerecherea ouălor sunt trăsături reproductive esențiale, înțelegerea modului în care țânțarii Anopheles femele integrează aceste semnale hormonale ar putea facilita proiectarea de noi programe de control al malariei. Aici, dezvăluim că aceste funcții reproductive sunt reglate de steroizi sexuali diferiți printr-o rețea complexă de enzime activatoare/inactivatoare de ecdisteroidi. Am identificat o ecdizonă oxidată specifică masculului, 3-dehidro-20E (3D20E), care protejează filiația prin oprirea receptivității sexuale a femelelor după transferul sexual și activarea prin defosforilare. În special, transferul 3D20E a indus, de asemenea, expresia genelor reproductive care mențin dezvoltarea ouălor în timpul infecției cu Plasmodium, asigurând sănătatea femelelor infectate. 20E derivat de la femele nu provoacă o relație sexuală. răspuns, dar permite indivizilor care se împerechează să depună ouă după ce kinazele inhibatoare de 20E sunt inhibate. Identificarea acestui hormon steroid specific insectelor masculine și rolul său în reglarea receptivității sexuale feminine, a fertilității și a interacțiunii cu Plasmodium sugerează potențialul de a reduce succesul reproductiv al țânțarilor transmițători de malarie.
Cazurile de malarie și decesele sunt din nou în creștere4 din cauza rezistenței pe scară largă la insecticide la țânțarii Anopheles, singurul vector al paraziților malariei umane. Biologia de împerechere a acestor țânțari este o țintă deosebit de atractivă pentru intervențiile inovatoare de control al malariei, deoarece femelele se împerechează o singură dată5; sterilizarea acestui singur eveniment de împerechere ar avea un mare potențial de a reduce populațiile de țânțari pe teren.
Femeile devin incapabile sexual după ce primesc hormoni steroizi cu titru ridicat de la bărbați. Studiile au arătat că factorul declanșator al dificultăților în împerecherea ulterioară este 20-hidroxiecdizona (20E), un hormon steroid mai cunoscut ca regulator al ciclului de năpârlire în stadiul larvar. Capacitatea masculilor de a sintetiza și transfera 20E a evoluat în mod specific la speciile de Anopheles care fac parte din subgenul Cellia7, care este distribuit în Africa și include cei mai periculoși vectori ai malariei, inclusiv Anopheles gambiae. Acest lucru este deosebit de remarcabil deoarece la aceste specii femelele produc și 20E după fiecare masă de sânge, iar 20E conduce ciclul de oogeneză (vezi ref. 8). Cu toate acestea, se cunosc puține lucruri despre modul în care femelele integrează semnale din două surse diferite de ecdizonă (transferul masculilor și inducerea hrănirii cu sânge) fără a compromite propria capacitate de împerechere. De fapt, dacă 20E produs de femele declanșează intoleranță sexuală, aceasta va duce la infertilitate la indivizii care se hrănesc virgin, un comportament foarte frecvent la acești țânțari5.
O posibilă explicație este că masculii de A. gambiae transferă o ecdizonă modificată specifică masculului, care activează o cascadă de semnalizare în tractul reproducător feminin, rezultând instabilitate la împerechere. Cu toate acestea, deși vertebratele au mai mulți hormoni steroizi, cum ar fi estrogenul și androgenul (revizuiți în ref. 9), din câte știm, steroizii cu tendință androgenică nu au fost identificați la insecte.
Ne-am propus să determinăm repertoriul hormonilor steroizi din glanda accesorie masculină (MAG) a A. gambiae matură sexual, în căutarea unor posibili steroizi modificatori. Folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu spectrometrie de masă în tandem (HPLC-MS/MS), în loc de metoda mai puțin specifică utilizată anterior, am detectat ecdizonă (E) și 20E în acest țesut, confirmând rezultatul anterior. Cu toate acestea, proba a fost dominată de steroizi fosforilați oxidați, în concordanță cu formula 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Figura 1). Alte forme includ 3-dehidro-20E (3D20E) și 20E-22-fosfat (20E22P). Intensitatea semnalului HPLC-MS/MS al 3D20E22P a fost cu două ordine de mărime mai mare decât forma sa defosforilată, 3D20E, și cu trei ordine de mărime mai mare decât cea a E și 20E (Figura 1). Deși în alte părți ale corpului și în partea inferioară... tractul reproducător (LRT; Date extinse Fig. 1a). De asemenea, am analizat ecdisteroidii la masculi și femele recent închise (<1 zi) și am detectat 3D20E și 3D20E22P doar în MAG; E, 20E și 20E22P au fost prezenți la ambele sexe (Date extinse Fig. 1b). Aceste date sugerează că masculii adulți de A. gambiae produc titruri ridicate de hormoni modificatori în MAG-urile lor, care nu sunt sintetizați de femele.
MAG și LRT femele (inclusiv atrii, vezicule seminale și parovaria) au fost disecate de la masculi virgini în vârstă de 4 zile (4 zile) și femele virgine și împerecheate (0,5, 3 și 12 hpm). Ecdizona din aceste țesuturi a fost analizată prin HPLC-MS/MS (medie ± sem; test t nepereche, bilateral, corectată pentru rata de descoperire falsă (FDR); NS, nesemnificativ; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 ore vs. 0,5 ore, P = 0,035; 12 ore vs. 3 ore, P = 0,0015; 12 ore vs. 0,5 ore, P = 0,030. 3D20E22P: 3 ore vs. 0,5 ore, P = 0,25; 12 ore vs. 3 ore, P = 0,0032; 12 ore vs. 0,5 ore, P = 0,015). Datele provin din trei replicări biologice. Aria vârfului pentru fiecare ecdizonă de interes a fost calculată și normalizată în funcție de numărul de țânțari. Ecdizona este reprezentată prin următoarele culori: E, verde; 20E, portocaliu; 20E22P, violet; 3D20E, albastru; 3D20E22P, roz. Inserția mărește scara pe axa y pentru a arăta niveluri mai scăzute de ecdizonă.
Pentru a investiga dacă 3D20E22P și 3D20E sunt transferate în timpul împerecherii, am disecat LRT-uri femele la diferite momente după împerechere. Deși ecdizona nu a fost găsită la femele virgine, am observat cantități substanțiale de 3D20E22P în LRT imediat după împerechere (0,5 ore după împerechere, hpm), acestea scăzând în timp, în timp ce nivelurile de 3D20E au crescut semnificativ (Fig. 1). Folosind 3D20E sintetizat chimic ca standard, am stabilit că nivelurile acestui hormon steroid în LRT-urile de împerechere au fost de cel puțin 100 de ori mai mari decât 20E (Tabelul cu date extinse 1). Astfel, 3D20E22P este principala ecdizonă masculină care este transferată la LRT-ul femelă în timpul împerecherii, iar forma sa defosforilată, 3D20E, devine foarte abundentă la scurt timp după împerechere. Acest lucru sugerează un rol important al acestei din urmă ecdizone în biologia post-împerechere a femelelor.
După generarea unui nou set de date de secvențiere ARN (RNA-seq) (Fig. 2a), utilizând o conductă bioinformatică construită personalizat, am căutat ecdizon kinaza (EcK), ecdizon oxidaza (EO) și ecdizona care codifică gena fosfatazei modificate cu 20E. EPP) este exprimată în țesuturile reproducătoare. Am identificat o genă EPP candidată și două gene EcK potențiale (EcK1 și EcK2), dar nu am reușit să găsim o genă EO candidată bună. În special, genele EPP individuale au fost exprimate la niveluri ridicate (percentila 98,9) în MAG-urile gambiene, dar nu și în LRT-urile feminine (Fig. 2b), contrar așteptărilor noastre, deoarece defosforilarea 3D20E22P a avut loc în acest țesut feminin. Prin urmare, credem că EPP masculin poate fi transferat în timpul împerecherii. Într-adevăr, am folosit marcarea cu izotopi stabili in vivo pentru a masca proteina feminină după împerechere, o enzimă identificată prin MS în atriul feminin (Fig. 2c și Tabelul suplimentar 1). Prezența EPP în MAG și LRT femele împerecheate (dar nu virgine) a fost, de asemenea, confirmată folosind anticorpi specifici (Fig. 2d).
a, O conductă bioinformatică construită la comandă pentru a căuta în țesuturile reproducătoare ale fiecărui sex gene care codifică EcK, EO și EPP. Numerele de lângă săgeți indică numărul de candidați masculi și femele la fiecare etapă. Această analiză a identificat o genă EPP (EPP) și o genă EcK (EcK1) care sunt exprimate la masculi și o genă EcK (EcK2) care este exprimată la ambele sexe, dar nu produce o genă EO candidată. b, Hartă termică care compară expresia genelor candidate în țesuturile virgine (V) și în perioada de împerechere (M) de Anopheles gambiae și Anopheles albicans. Spca, fertilizare; MAG, glande accesorii la masculi; alte părți ale corpului, inclusiv sânii, aripile, picioarele, corpurile adipoase și organele interne la ambele sexe și ovarele la femele. EcK2 este exprimată la niveluri ridicate atât în MAG, cât și în atriile Gambiei, în timp ce EPP se găsește doar în MAG. c, Analiza proteomică a translocării grupului de ejaculat masculin în atriile feminine la 3, 12 și 24 hpm, arătând cele mai abundente 67 de proteine. Femelele au fost crescute cu o dietă care conține 15N pentru a marca (și masca) toate proteinele. Masculii nemarcați au fost împerecheați cu femele marcate, iar LRT-urile feminine au fost disecate la 3, 12 și 24 hpm pentru analiza proteomică (vezi tabelul suplimentar 1 pentru o listă completă a proteinelor ejaculatorii). Inserție, EPP, Eck1 și EcK2 au fost detectate în MAG masculilor virgini prin analiza proteomică a acestor țesuturi. d, EPP a fost detectat prin western blot în MAG și LRT ale femelelor împerecheate, dar nu la femelele sau masculii virgini sau la restul femelei. Membranele au fost sondate simultan cu anticorpi anti-actină (control al încărcării) și anticorpi anti-EPP. Toți bărbații sunt virgini. Vezi Figura suplimentară 1 pentru datele sursei de gel. Western blot-urile au fost efectuate de două ori cu rezultate similare.
Activitatea ecdisteroid fosfofosfatazei EPP a fost verificată după incubare prin HPLC-MS/MS cu 3D20E22P izolat din MAG (Date extinse Fig. 2a). În plus, atunci când am redus la tăcere EPP prin interferență mediată de ARN (ARNi), am detectat o reducere puternică a activității fosfatazei în țesuturile reproducătoare ale acestor masculi (Fig. 3a), iar femelele împerecheate cu masculi cu EPP redus la tăcere au prezentat o proporție semnificativ mai mică de 3D20E defosforilat (Fig. 3b), în ciuda reducerii parțiale a genei (Date extinse Fig. 2b,c). În schimb, nu am detectat modificări semnificative ale raportului 20E22P/20E la aceiași țânțari, ceea ce ar putea sugera că enzima este specifică pentru 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Activitate scăzută a fosfatazei în MAG cauzată de reducerea la tăcere a EPP utilizând controale cu ARN EPP dublu catenar (dsEPP) sau ARN GFP dublu catenar (dsGFP). Douăzeci de grupuri MAG au fost utilizate în fiecare replică (P = 0,0046, test t pereche, bilateral), reprezentate prin puncte separate. b, Femelele împerecheate cu masculi cu reducere la tăcere a EPP au avut o proporție semnificativ mai mică de 3D20E defosforilat la 3 hpm (P = 0,0043, test t nepereche, bilateral), în timp ce nivelurile de 20E nu au fost afectate (P = 0,063, nepereche). Test t, bilateral). Datele sunt prezentate ca medie ± sem din trei grupuri de câte 13, 16 și 19 femele fiecare.c, Femelele împerecheate cu masculi silențioși cu EPP au avut rate semnificativ mai mari de reîmperechere (P = 0,0002, test exact Fisher, bilateral). Femelele au fost mai întâi forțate să se împerecheze pentru a-și asigura statutul de împerechere; 2 zile mai târziu, au fost contactați cu alți masculi purtători de spermă transgenică pentru a evalua ratele de reîmperechere prin detectarea PCR cantitativă a transgenei.d, Femelele hrănite cu sânge, împerecheate cu masculi silențioși cu EPP, au avut o fertilitate semnificativ redusă (P < 0,0001; testul Mann-Whitney, bilateral) și un număr ușor redus de ouă (P = 0,088, testul Mann-Whitney, bilateral), în timp ce rata de depunere a icrelor nu a fost afectată (P = 0,94, testul exact Fisher, bilateral). În toate panourile, n reprezintă numărul de probe de țânțari biologic independente. NS, nesemnificativ. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
În continuare, am evaluat dacă defosforilarea ecdizonei este importantă pentru inducerea rezistenței la împerechere la femele. În special, femelele împerecheate cu masculi cu deficit de EPP s-au reîmperecheat la o frecvență mult mai mare (44,9%) decât femelele de control (10,4%) atunci când au fost expuse la masculi suplimentari (transgenici) (Fig. 3c). De asemenea, am observat o scădere semnificativă a fertilității (Fig. 3d, stânga) și o ușoară scădere a numărului de ouă depuse de aceste femele (Fig. 3d, mijloc), în timp ce procentul de ouă depuse de femele (un alt răspuns provocat la femele prin împerechere) nu a fost afectat (Fig. 3d, dreapta). Având în vedere specificitatea observată a EPP pentru 3D20E22P, aceste rezultate sugerează că activarea 3D20E de către EPP transferat în timpul împerecherii poate avea un rol important în oprirea receptivității femelelor la împerecherea ulterioară, un comportament atribuit anterior transferului sexual de 20E. Prin urmare, acest hormon specific masculilor afectează, de asemenea, puternic fertilitatea femelelor.
În continuare, am comparat activitățile 20E și 3D20E în experimentele de injectare la femele virgine mature sexual, utilizând 3D20E sintetizat chimic (Fig. 4a-c) și 20E disponibil comercial. Am observat că 3D20E a fost semnificativ mai eficient decât 20E în oprirea sensibilității femelelor la împerechere la ambele concentrații (Fig. 4d). În special, jumătate din nivelul fiziologic al 3D20E în LRT (1.066 pg după injecție vs. 2.022 pg după împerechere) a indus o proporție de femele refractare de 20 de ori mai mare decât nivelul fiziologic al 20E (361 pg după injecție) la 24 de ore după injecție la cea mai mare concentrație, 18 pg după împerechere; Tabelul de date extins 1). Acest rezultat este în concordanță cu ideea că transferul sexual al genei 20E nu provoacă perioade refractare la împerechere și indică în continuare gena 3D20E ca un factor major în asigurarea relației părinte-copil. De asemenea, gena 3D20E a fost semnificativ mai activă decât gena 20E în testele de depunere a ouălor la femele virgine (Fig. 4e), sugerând că rata normală de depunere a ouălor observată după reducerea parțială a EPP s-a datorat prezenței activității reziduale a genei 3D20E, produsă încă de factorii femele induși de împerechere.
(a,b) 3D20E sintetizat chimic din 20E (a) cu conversie/eficiență foarte ridicată (date prezentate ca medie ± sem din trei reacții de sinteză independente) (b).c, Spectrul de masă (jumătatea inferioară) corespunde exact cu ecdizona găsită în LRT femele împerecheate (jumătatea superioară).d, Comparativ cu 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; testul exact Fisher, bilateral) și etanol 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; testul exact Fisher, bilateral), în timp ce 20E a fost semnificativ mai mare decât controlul doar la doze mai mari (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; testul exact Fisher, bilateral).e, 3D20E Injecția a indus rate de depunere a icrelor semnificativ mai mari la femelele virgine decât la grupul de control tratat cu etanol 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; testul exact Fisher, bilateral), în timp ce 20E, comparativ cu grupul de control, a indus rate de depunere a icrelor semnificativ mai mari decât 20E la doze mai mari (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; testul exact Fisher, bilateral). 3D20E a indus rate de depunere a icrelor semnificativ mai mari decât 20E la doze mai mari (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; testul exact Fisher, bilateral). În toate panourile, n reprezintă numărul de probe de țânțari biologic independente. NS, nesemnificativ. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Datele provin din trei replicări.
În studiile anterioare, am stabilit că transferul sexual de hormoni steroizi induce expresia MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), o genă reproductivă feminină care protejează femelele A. gambiae de infecția cu P. falciparum. Costurile de sănătate cauzate de 13, cel mai mortal parazit al malariei umane. Având în vedere importanța MISO pentru capacitatea reproductivă a Anopheles în zonele endemice de malarie, am decis să determinăm care hormon 3D20E sau 20E declanșează expresia acestei gene. Am descoperit că, deși injecția cu 20E a indus în mod specific sau mai puternic unii receptori hormonali nucleari (HR), cum ar fi HR3 și HR4, și ținte steroizi tipice din aval, cum ar fi genele yolkogenice Vg14, 15, 16, MISO a fost indus mai puternic de 3D20E (Date extinse Fig. 3). Astfel, transferul sexual al acestui hormon steroid androgenic pare să inducă mecanisme care protejează femelele de costurile generate de infecția parazitară. În plus, 3D20E afectează diferențiat ambele izoforme ale receptorului EcR, inducând EcR-A și reprimând EcR-B și declanșând mai puternic alte gene care induc împerecherea, inclusiv HPX15, care afectează fertilitatea feminină. Acest lucru ar putea explica infertilitatea semnificativă observată la femelele împerecheate cu masculi cu EPP silențios (Date extinse, Fig. 3). Aceste date sugerează existența unor căi în aval activate preferențial de doi hormoni ecdizonici care ar putea sta la baza funcției specifice sexului.
În continuare, am testat funcția celor două gene EcK identificate în cadrul producției noastre bioinformatice. Reducerea la tăcere a EcK1 sau EcK2 a dus la o mortalitate semnificativă la masculi (Date extinse Fig. 4a), sugerând că fosforilarea ecdizonei și, prin urmare, inactivarea, este importantă pentru supraviețuire. Deoarece EcK2 a fost exprimată la niveluri mai ridicate decât EcK1 și a fost detectată în MAG prin proteomică (Fig. 2b, c și Tabelul suplimentar 2), am validat activitatea kinazei sale ecdisteroide prin incubarea acesteia cu 20E, ceea ce a dus la fosforilarea 20E22P (Date extinse Figura 2). 4b). Când am folosit 3D20E ca substrat, nu am putut detecta produsul fosforilat 3D20E22P (Date extinse Fig. 4c), sugerând că 20E, mai degrabă decât 3D20E, ar putea fi ținta preferată a EcK2.
Conform analizei noastre RNA-seq, EcK2 a fost, de asemenea, exprimată la nivel înalt în LRT-ul femelelor virgine, unde a fost oprită după împerechere (Fig. 2b). Am confirmat aceste date și am stabilit că expresia EcK2 nu a fost afectată de hrănirea cu sânge (Date extinse Fig. 5a). Extinzând experimentele noastre inițiale MS, am stabilit că vârful 20E22P a fost strâns legat de vârful 20E (22-26 de ore după ingestia de sânge; Date extinse Fig. 5b). Reducerea la tăcere a EcK2 la femelele virgine a dus la o creștere de 3 ori a raportului relativ dintre 20E și 20E22P la 26 de ore după ingestia de sânge (Date extinse Fig. 2c și 5c), confirmând că EcK2 fosforilează și 20E la femele. În special, femelele virgine cu deficit de EcK2 au menținut receptivitatea sexuală completă (Date extinse Fig. 5d,e), sugerând în continuare că producția de 20E de către femele nu induce perioade refractare la împerechere. Cu toate acestea, aceste femele au avut rate de depunere a ouălor semnificativ crescute în comparație cu grupul de control, cu peste 30% dintre virgine depunând ouă (Date extinse Fig. 5f). Dacă injecțiile cu ARN Eck2 dublu catenar (dsEcK2) au fost efectuate după hrănirea cu sânge, depunerea ouălor nu a avut loc, moment în care vârful 20E datorat ingerării de sânge a scăzut. Per total, aceste rezultate susțin un model conform căruia 20E produs după suptul sângelui poate induce depunerea ouălor, dar numai atunci când blocarea depunerii ouălor (EcK2 și posibil alți factori) este oprit prin împerechere. Nici injecțiile cu 20E, nici cele cu 3D20E nu au inhibat expresia EcK2 la virgine (Date extinse Fig. 5g), sugerând că alți factori mediază inhibarea acestei kinaze. Cu toate acestea, nivelurile de 20E după hrănirea cu sânge nu au fost suficiente pentru a induce disconfort la împerechere, ci au fost declanșate eficient de titruri ridicate de 3D20E transferat sexual.
Rezultatele noastre oferă perspective importante asupra mecanismelor care reglează succesul reproductiv al A. gambiae. A apărut un model în care masculii au evoluat pentru a sintetiza titruri ridicate de 3D20E, o ecdizonă modificată specifică masculului care asigură filiația prin desensibilizarea femelelor la împerecherea ulterioară. În același timp, acești vectori ai malariei au dezvoltat și un sistem eficient pentru a activa 3D20E la femele ca răspuns la transferul sexual de EPP specific masculului. Din câte știm, acesta este primul exemplu de sistem hormonal steroizi dominat de masculi și femele care îndeplinește o funcție unică și critică la insecte. Funcția ecdizonei specifice masculilor a fost postulată, dar nu demonstrată definitiv. De exemplu, o ipoteză în mare parte infirmată18 este că aceste funcții pot fi îndeplinite de precursorul 20E E1. Este bine cunoscut faptul că la Drosophila, monandria este declanșată de transferul sexual de peptide sexuale mici19,20 care interacționează cu neuronii care inervează tractul reproducător feminin prin intermediul unor receptori specifici de peptide sexuale21,22. Sunt necesare lucrări suplimentare pentru a determina cascadele de semnalizare din aval. controlată de 3D20E la femelele de A. gambiae și pentru a determina dacă aceste cascade pot fi conservate între țânțari și Drosophila.
Având în vedere rolul important al genei 3D20E asupra fertilității și comportamentului femelelor identificat în studiul nostru, căile care duc la sinteza și activarea genei 3D20E oferă noi oportunități pentru viitoarele strategii de control al țânțarilor, cum ar fi generarea de masculi sterili competitivi în strategiile tehnologiei insectelor sterile. Utilizarea pentru eliberarea în sălbăticie sau pentru a imita gena 3D20E în jocurile cu insecte virgine. Funcția specifică masculilor a genei 3D20E ar fi putut evolua atunci când A. gambiae și alte specii de Cellia au dobândit capacitatea de a-și coagula sperma în dopuri de împerechere, deoarece acest lucru permite transferul eficient al unui număr mare de hormoni și enzime activatoare de hormoni. La rândul său, evoluția genei 3D20E care implementează monandria oferă un mecanism pentru femele (prin expresia ridicată a MISO) de a favoriza capacitatea lor reproductivă în zonele cu prevalență ridicată a malariei, ceea ce contribuie indirect la transmiterea Plasmodium. Având în vedere că s-a demonstrat că gena 20E femelă are efecte profunde asupra supraviețuirii și creșterii genei P. falciparum la țânțarii Anopheles femele,24 atât căile hormonilor steroizi masculini, cât și feminini sunt acum aspecte cheie ale interacțiunilor țânțar-parazit.
Tulpinile A. gambiae G3 au fost crescute în condiții standard pentru insecte (26-28 °C, umiditate relativă 65-80%, fotoperioadă lumină/întuneric 12:12 h). Larvele au fost hrănite cu hrană pentru pești sub formă de puf (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets și Tetra Pond Sticks într-un raport de 7:7:2). Țânțarii adulți au fost hrăniți ad libitum cu soluție de dextroză 10% și sânge uman săptămânal (componente sanguine studiate). Țânțarii virgini au fost obținuți prin segregarea sexelor în stadiul de pupă, după examinarea capetelor prin microscopie. Masculii purtători ai transgenei DsRed au fost descriși anterior.
Experimentele de împerechere forțată au fost efectuate conform protocoalelor descrise anterior. Pentru împerecherea naturală, femelele virgine în vârstă de 4 zile au fost ținute într-un raport de 1:3 cu masculii virgini maturi sexual timp de două nopți. Pentru experimentele în care masculii au fost injectați cu dsEPP, co-cating-ul a coincis cu zilele 3-4 după injectare, când activitatea fosfatazei a fost redusă la maximum (Date extinse Fig. 2b).
Țesuturile de țânțari, cadavrele rămase (restul corpului) sau întregul corp au fost disecate în metanol 100% și omogenizate cu un aparat de extracție cu sfere (bile de sticlă de 2 mm, 2.400 rpm, 90 sec). Cantitățile de țesut și volumele de metanol au fost următoarele: restul corpului, 50 în 1.000 µl; MAG, 50–100 × 80 µl; LRT femelă, 25–50 × 80 µl. Precipitatul a fost supus unei a doua extracții cu metanol cu același volum de metanol. Resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare. Metanolul din ambele extracții a fost combinat și uscat sub flux de azot, apoi resuspendat în următoarele volume de metanol 80% în apă: restul corpului, 50 µl; MAG și LRT femelă, 30 µl.
Probele au fost analizate pe un spectrometru de masă (ID-X, Thermo Fisher) cuplat la un instrument LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl de probă au fost injectați pe o coloană de 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) menținută la 25 °C. Fazele mobile pentru LC au fost A (apă, 0,1% acid formic) și B (acetonitril, 0,1% acid formic). Gradientul LC a fost următorul: 5% B timp de 1 minut, apoi crescut la 100% B pe parcursul a 11 minute. După 8 minute la 100%, se reechilibrează coloana la 5% B timp de 4 minute. Debitul a fost de 0,3 ml min-1. Ionizarea în sursa MS se realizează prin ionizare prin electrospray încălzită în moduri pozitive și negative.
Spectrometrul de masă măsoară date în intervalul m/z de la 350 la 680 la o rezoluție de 60.000 în modul MS complet. Datele MS/MS au fost achiziționate pe [M + H]+ (toate țintele), [M - H2O + H]+ (toate țintele) și [M - H]- (ținte fosforilate). Datele MS/MS au fost utilizate pentru a confirma proprietățile ecdizonei țintelor pentru care nu era disponibil niciun standard. Pentru a identifica ecdisteroizii nețintiți, au fost analizate date MS/MS pentru toate vârfurile HPLC cu o abundență relativă >15%. Cuantificarea se face folosind curbe standard create din standarde pure (20E, 3D20E) pentru a calcula cantitățile absolute sau diluțiile unei probe specifice (toate celelalte ținte) pentru a calcula echivalența lor cu cantitățile găsite la un mascul. Pentru 3D20E, cuantificarea a fost efectuată folosind suma următorilor aducți: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Datele au fost extrase și cuantificate folosind Tracefinder (versiunea 4.1). Datele MS/MS au fost analizate folosind Xcalibur (versiunea 4.4). Spectrele MS ale E, 20E și 3D20E au fost comparate cu standardele respective. 3D20E22P a fost analizat prin derivatizare cu reactivul Girard. 20E22P a fost analizat prin raportul m/z.
3D20E22P a fost purificat din MAG. Purificarea a fost efectuată la scară analitică utilizând un cromatograf de lichide ultraperformant (Acquity, Waters) cu un detector cuadripol bazat pe masă (QDa, Acquity, Waters) în aceleași condiții LC ca și analiza HPLC-MS/MS. Colectarea fracțiilor a fost declanșată atunci când m/z corespunzător lui 3D20E22P a fost detectat la același timp de retenție ca cel determinat anterior. Puritatea compușilor extrași a fost apoi verificată prin HPLC-MS/MS așa cum s-a descris mai sus.
ARN-ul total a fost extras din 10-12 țesuturi reproductive sau alte părți ale corpului (fără cap) folosind reactivul TRI (Thermo Fisher), urmând instrucțiunile producătorului. ARN-ul a fost tratat cu TURBO DNază (Thermo Fisher). ADNc a fost sintetizat folosind transcriptază inversă a virusului leucemiei murine Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher), urmând instrucțiunile producătorului. Primerii pentru PCR cantitativ cu transcripție inversă (RT-qPCR; Tabelul de date extins 2) au fost publicați anterior24 sau proiectați folosind Primer-BLAST26, preferându-se produsele cu dimensiunea de 70-150 pb și care se întind pe joncțiuni exon-exon sau primeri perechi de primeri pentru exoni separați. Probele de ADNc din trei până la patru replici biologice au fost diluate de patru ori în apă pentru RT-qPCR. Cuantificarea a fost efectuată în reacții replicate de 15 µl conținând 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primeri și 5 µl de ADNc diluat. Reacțiile au fost rulate pe un QuantStudio 6 Pro Sistem PCR în timp real (Thermo Fisher), iar datele au fost colectate și analizate utilizând Design and Analysis (versiunea 2.4.3). Așa cum s-a demonstrat în acest studiu, cantitățile relative au fost normalizate în raport cu gena ribozomală RpL19 (AGAP004422), a cărei expresie nu s-a modificat semnificativ odată cu hrănirea cu sânge27 sau împerecherea3.
Calitatea ARN-ului a fost verificată utilizând un Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliotecile Illumina cu capete pereche au fost pregătite și rulate la Institutul Broad din MIT și Harvard. Citirile de secvențiere au fost aliniate la genomul A. gambiae (tulpina PEST, versiunea 4.12) utilizând HISAT2 (versiunea 2.0.5) cu parametri impliciți. Citirile cu scoruri de calitate a mapării (MAPQ) <30 au fost eliminate utilizând Samtools (versiunea 1.3.1). Numărul de citiri mapate la gene a fost numărat utilizând htseq-count (versiunea 0.9.1) cu parametri impliciți. Numărul de citiri normalizate a fost calculat, iar expresia genelor diferențiale a fost analizată utilizând pachetul DESeq2 (versiunea 1.28.1) în R (versiunea 4.0.3).
Genele candidate modificatoare de ecdizonă au fost identificate prin căutarea mai întâi a genomului A. gambiae folosind algoritmul PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), utilizând valori implicite ale parametrilor cu următoarele secvențe proteice de interogare: de la Bombyx mori (număr de acces NP_001038956.1), Musca domestica (număr de acces XP_005182020.1, XP_005175332.1 și XP_011294434.1) și Microplitis demolitor (număr de acces XP_008552646.1 și XP_008552645.1), EcK de la B. mori (număr de acces NP_001036900), Drosophila melanogaster (număr de acces NP_651202), Apis mellifera. (nr. de acces XP_394838) și Acyrthosiphon pisum (nr. de acces XP_001947166); și EPP de la B. mori (nr. de acces XP_001947166) NP_001177919.1 și NP_001243996.1) și EO de la D. melanogaster (nr. de acces NP_572986.1) (etapa 1). Apoi, filtrați rezultatele pe baza expresiei ridicate a ARNm (>100 fragmente/kilobaze de exoni per milion de citiri mapate (FPKM) sau >85%) în țesutul reproducător (LRT feminin sau MAG) în Gambia (etapa 2). Pentru a îmbunătăți specificitatea, am selectat enzime candidate care sunt exprimate și în țesutul reproducător al A. albimanus, o specie de anofel care nu sintetizează și nu transferă ecdizonă în timpul împerecherii. Genele candidate au fost filtrate pe baza expresiei scăzute (<100 FPKM sau
Femele virgine marcate cu 15N, în vârstă de 4-6 zile, au fost forțate să se împerecheze cu masculi virgini nemarcați de aceeași vârstă. Împerecherea reușită a fost verificată prin detectarea dopurilor de împerechere la microscopie cu epifluorescență. La 3, 12 și 24 hpm, atriile a 45-55 de femele împerecheate au fost disecate în 50 µl de tampon bicarbonat de amoniu (pH 7,8) și omogenizate cu un pistil. Omogenatul a fost centrifugat, iar supernatantul a fost amestecat cu 50 µl de RapiGest 0,1% (186001860, Waters) în bicarbonat de amoniu 50 mM. Supernatantul și peleta din fiecare probă au fost congelate rapid pe gheață carbonică și expediate peste noapte la laboratorul MacCoss de la Universitatea din Washington, unde a fost finalizată pregătirea probei pentru LC-MS/MS. Resuspendați peleta în 50 µl de RapiGest 0,1% în bicarbonat de amoniu 50 mM și sonicare într-o baie de apă. Concentrația de proteine din pellet și supernatant a fost măsurată prin testul BCA, probele au fost reduse cu 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma), alchilate cu 15 mM iodoacetamidă (Sigma) și incubate la 37 °C (1:0 50) timp de 1 oră cu raport tripsinizare:tripsină:substrat). RapiGest a fost lizat prin adăugarea de 200 mM HCl, urmată de incubare la 37 °C timp de 45 de minute și centrifugare la 14.000 rpm timp de 10 minute la 4 °C pentru a îndepărta resturile. Probele au fost spălate prin extracție în fază solidă în mod dual (cartușe Oasis MCX, Waters) și resuspendate în acid formic 0,1% pentru o concentrație finală de proteine de 0,33 µg µl-1. Proteomii MAG nemarcați au fost analizați în mod similar de la masculi virgini. Două replici analitice au fost analizate pentru fiecare probă. În continuare, 1 µg din fiecare a fost analizat utilizând o coloană de silice topită de 25 cm cu 75 μm, cu o capcană de frită Kasil1 (PQ) de silice topită de 4 cm, umplută cu rășină în fază inversă Jupiter C12 (Phenomenex) și cromatografie lichidă timp de 180 de minute. Digeste de probe – MS/MS a fost rulat pe un spectrometru de masă Q-Exactive HF (Thermo Fisher) cu un sistem nanoACQUITY UPLC (Waters). Datele de achiziție legate de date generate pentru fiecare rulare au fost convertite în format mzML folosind Proteowizard (versiunea 3.0.20287) și folosind Comet31 (versiunea 3.2) pe baza de date FASTA care conține secvențe de proteine de la Anopheles gambiae (VectorBase versiunea 54), Anopheles coluzzi. A fost efectuată o căutare pe Mali-NIH (VectorBase versiunea 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, martie 2021), A. gambiae RNA-seq și traduceri în trei cadre ale contaminanților umani cunoscuți. FDR-urile potrivite cu harta peptidelor au fost determinate folosind Percolator32 (versiunea 3.05) cu un prag de 0,01, iar peptidele au fost asamblate în identificări de proteine folosind parsimonia proteinelor în Limelight33 (versiunea 2.2.0). Proteine relative Abundența a fost estimată utilizând factorul de abundență spectrală normalizat (NSAF) calculat pentru fiecare proteină din fiecare rundă, așa cum s-a descris anterior. NSAF relativ la fiecare proteină a fost mediat pe probe din două replici biologice diferite. Marcarea cu 15N a mascat cu succes proteomul feminin, deși o cantitate mică de proteină nemarcată a putut fi detectată din virginele marcate. Am înregistrat detectarea reducerii proteinelor masculine (spectre 1-5) în probele brute feminine numai în rundele tehnice, unde probele brute au fost rulate după probele masculine/de împerechere, ca urmare a „transportului” HPLC. Proteinele ocazionale găsite ca „contaminanți” din virginele marcate sunt enumerate în Tabelul suplimentar 1.
Două peptide antigenice, QTTDRVAPAPDQQQ (în izotipul PA) și MESDGTTPSGDSEQ (în izotipul PA și PB) în Genscript. Cele două peptide au fost combinate, apoi conjugate cu proteina purtătoare KLH și injectate în iepuri din Noua Zeelandă. Iepurii au fost sacrificați după a patra injecție, iar IgG totală a fost izolată prin purificare prin afinitate. IgG de la iepurele cu cea mai mare specificitate pentru EPP a fost utilizată pentru Western blotting suplimentar.
Pentru Western blots, s-au adăugat separat MAG (n = 10, unde n reprezintă numărul de probe de țânțari biologic independente) și LRT femele (n = 30) de la masculi virgini în vârstă de 4 zile și femele virgine sau împerecheate forțat (<10 după împerechere). Soluție tampon de extracție proteică (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% deoxicolat de sodiu; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× cocktail inhibitor de protează (Roche)). Probele au fost omogenizate imediat după disecție cu un beader (bile de sticlă de 2 mm, 2.400 rpm, 90 sec). Resturile insolubile au fost îndepărtate prin centrifugare la 20.000 g la 4 °C. Proteinele au fost cuantificate prin testul Bradford (Bio-Rad). Apoi, s-au adăugat 20 µg de proteină MAG, 40 µg de proteină LRT și 20 µg de proteină reziduală în vrac. au fost denaturate și separate prin 10% Bis-Tris NuPAGE folosind tampon MOPS. Proteinele au fost transferate pe membrane de fluorură de poliviniliden folosind sistemul de transfer iBlot2 (Thermo Fisher). Membranele au fost spălate de două ori în 1× PBS-T (0,1% Tween-20 în PBS) și apoi blocate în tampon de blocare Odyssey (Li-Cor) timp de 1 oră la 22°C. Membranele au fost agitate peste noapte la 4°C cu anticorp primar policlonal de iepure anti-EPP personalizat (1:700 în tampon de blocare) și anticorp primar monoclonal de șobolan anti-actină MAC237 (Abeam; 1:4.000). Membranele au fost spălate cu PBS-T și apoi incubate cu anticorpi secundari (măgar anti-iepure 800CW și capră anti-șobolan 680LT (Li-Cor), ambele 1:20.000) în tampon de blocare conținând 0,01% SDS și 0,2% Tween-20 timp de 1 oră. oră la 22 °C. Membranele au fost spălate cu PBS-T și înregistrate cu un scaner Odyssey CLx. Imaginile au fost colectate și procesate în Image Studio (versiunea 5.2). Nu a fost detectată o bandă specifică corespunzătoare izoformei EPP-RA (82 kDa).
Regiunile codificatoare ale EPP (ca izoformă AGAP002463-RB care conține domeniul histidină fosfatază, căutare domeniu conservat NCBI 34) și EcK2 (AGAP002181) au fost clonate în plasmida pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Primerii sunt listați în Tabelul de date extins 2. Opt linkeri GS4 (în tandem) au fost inserați înainte de eticheta 6xHis C-terminală a constructului pET-21a(+)-EcK2. Proteinele recombinante au fost produse folosind reacția de sinteză a proteinelor E. coli fără celule NEBExpress (New England BioLabs). Proteinele recombinante au fost purificate folosind coloane de spin NEBExpress Ni (New England BioLabs). Proteina de control dihidrofolat reductază (DHFR) a fost produsă folosind șablonul ADN din kitul de sinteză a proteinelor E. coli fără celule NEBExpress. Proteinele au fost depozitate în glicerol 50% în PBS la -20 °C timp de până la 3 luni.
Activitatea fosfatazei EPP și a extractelor de țesuturi a fost măsurată utilizând 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich). Tamponul de reacție conținea 25 mM Tris, 50 mM acid acetic, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA și 1 mM DTT. Țesutul a fost omogenizat în tamponul de reacție, iar resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare. Reacția se inițiază prin adăugarea de enzimă sau extract de țesut la tamponul de reacție care conține 2,5 mg ml-1 pNPP. Amestecul de reacție a fost incubat la temperatura camerei, la întuneric, iar cantitatea de pNP convertită din pNPP a fost cuantificată prin măsurarea absorbanței la 405 nm la diferiți momente.
Pentru activitatea EcK in vitro, proteina a fost incubată cu 0,2 mg de 20E sau 3D20E în 200 µl de tampon (pH 7,5) conținând 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP și 10 mM MgCl2 timp de 2 ore la 27 °C. Reacția a fost oprită prin adăugarea a 800 µl de metanol, apoi răcită la -20 °C timp de 1 oră, apoi centrifugată la 20.000 g timp de 10 minute la 4 °C. Supernatantul a fost apoi analizat prin HPLC-MS/MS. Pentru a inactiva termic proteinele utilizate în grupul de control, proteinele au fost incubate în glicerol 50% în PBS timp de 20 de minute la 95 °C.
Pentru activitatea EPP in vitro, proteina a fost incubată cu 3D20E22P (echivalent cu cantitatea găsită în 18 perechi de MAG, purificate prin HPLC-MS/MS) în 100 µl de tampon (pH 7,5) conținând 25 mM Tris, 50 mM acid acetic, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA și 1 mM DTT timp de 3 ore la 27 °C. Reacția a fost oprită prin adăugarea a 400 µl de metanol și răcită la -20 °C timp de 1 oră, apoi centrifugată la 20.000 g timp de 10 minute la 4 °C. Supernatantul a fost analizat prin HPLC-MS/MS.
Fragmentele PCR pentru EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) și EcK2 (556 pb) au fost amplificate din ADNc preparat din cadavre de țânțari fără cap de sexe mixte. Fragmentul PCR al controlului eGFP (495 pb) a fost amplificat din pCR2.1-eGFP descris anterior; Primerii PCR sunt listați în Tabelul de date extinse 2. Fragmentul PCR a fost inserat între promotorii T7 invertiți de pe plasmida pL4440. Construcțiile plasmidice au fost recuperate din E. coli competentă NEB 5-α (New England Biolabs) și verificate prin secvențiere ADN înainte de utilizare (vezi Datele suplimentare 1 pentru secvența inserției). Primerii potriviți cu promotorul T7 (Tabelul de date extinse 2) au fost utilizați pentru a amplifica inserția din plasmida pe bază de pL4440. Dimensiunea produsului PCR a fost confirmată prin electroforeză pe gel de agaroză. ARNds a fost transcris din șabloane PCR folosind kitul de transcriere Megascript T7 (Thermo Fisher) și purificat conform instrucțiunilor producătorului, cu modificările descrise anterior.
Pentru injectarea cu ARNdc, 1.380 ng de ARNdc (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) au fost injectate la o concentrație de 10 ng nl-1 în toracele masculilor sau femelelor adulți (Nanoject III, Drummond) în decurs de 1 zi de la ecloziune. Nivelurile de reducere a genelor au fost determinate în cel puțin trei replici biologice prin extracție de ARN, sinteză de ADNc și RT-qPCR. Pentru injectarea cu ecdizonă, femele hrănite cu sânge virgin, în vârstă de 4 zile sau virgin, în vârstă de 6 zile, au fost injectate cu 0,13, 0,21 sau 0,63 µg de 20E sau 3D20E (Nanoject III, Drummond) la concentrații de 1,3, respectiv 2,1, în funcție de designul experimental, sau 6,3 ng nl-1. Se injectează 100 nl de etanol 10% (vol/vol) în apă; 100 nl de 3D20E22P în etanol 10% (echivalentul a 75% din cantitatea găsită într-o pereche de MAG-uri). Țânțarii au fost repartizați aleatoriu în grupul de injectare.
Pentru testele de depunere a icrelor, femelele în vârstă de 3 zile au fost hrănite ad libitum cu sânge uman. Se îndepărtează țânțarii parțial hrăniți sau nehrăniți. În funcție de tratament, femelele au fost plasate în cupe separate de depunere a icrelor timp de patru nopți, la cel puțin 48 de ore după masa de sânge. Ouăle au fost numărate sub un stereoscop (Stemi 508, Zeiss); pentru femelele împerecheate, ouăle care au eclozat în larve au fost considerate fertile.
Pentru testele de împerechere, femelelor li s-au permis cel puțin 2 zile, în funcție de tratament, pentru a dezvolta rezistență la împerechere, iar masculii de tip sălbatic cu vârsta potrivită au fost ulterior introduși în aceeași cușcă. Două nopți mai târziu, veziculele fertilizate ale femelelor au fost disecate, iar ADN-ul genomic a fost eliberat prin congelare-decongelare și sonicare într-o soluție tampon conținând 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA și 25 mM NaCl (pH 8,2). Probele au fost incubate cu Proteinază K (0,86 µg µl-1) timp de 15 minute la 55 °C, urmate de 10 minute la 95 °C. Preparatele brute de ADN genomic au fost diluate de 10 ori și supuse detectării qPCR a secvențelor cromozomului Y; primerii sunt enumerați în Tabelul de date extinse 2. Absența secvenței cromozomului Y indică lipsa împerecherii.
Pentru testele de reîmperechere, femelele împerecheate forțat au fost examinate pentru prezența dopurilor de împerechere pentru a confirma starea de împerechere și li s-a permis 2 zile pentru a dezvolta refractaritate la împerechere în absența masculilor, așa cum s-a descris anterior 36. Masculii purtători de spermă transgenică DsRed au fost apoi introduși în cuștile femelelor. Două nopți mai târziu, veziculele de fertilizare au fost disecate de la femele, iar ADN-ul genomic a fost preparat așa cum s-a descris mai sus și supus detectării qPCR a transgenei DsRed; primerii sunt enumerați în Tabelul cu date extinse 2. Absența transgenei DsRed a indicat că nu a avut loc nicio reîmperechere.
3D20E a fost sintetizat așa cum s-a descris anterior37. Pe scurt, 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) au fost dizolvate în 10 ml de apă, urmate de adăugarea a 30 mg de negru de platină (sub formă de pulbere, Sigma-Aldrich). Un flux ușor de O2 a fost barbotat continuu în amestecul de reacție, care a fost agitat la temperatura camerei. După 6 ore, s-au adăugat 30 ml de metanol pentru a opri reacția. Amestecul a fost centrifugat pentru a îndepărta particulele de catalizator. Supernatantul a fost evaporat până la uscare în vid la temperatura camerei. Produsul de reacție uscat a fost dizolvat în etanol 10% și metanol pentru injectare pentru analiza HPLC-MS/MS. Rata de conversie (de la 20E la 3D20E) a fost de aproximativ 97% (Fig. 4b), iar spectrul MS al 3D20E sintetizat s-a potrivit cu cel găsit la femelele împerecheate (Fig. 4c).
Legenda conține detalii specifice ale testelor statistice efectuate. GraphPad (versiunea 9.0) a fost utilizat pentru a efectua testul exact Fisher, testul Mantel-Cox și testul t Student. Testele Cochran-Mantel-Haenszel au fost efectuate folosind un script R personalizat (disponibil la https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Distribuția datelor a fost testată pentru normalitate folosind testul Shapiro-Wilk cu un prag de semnificație de 0,05. Când datele nu au trecut testul de normalitate, a fost efectuat testul Mann-Whitney. Datele de supraviețuire au fost analizate folosind testul Mantel-Cox. Pachetul DESeq2 (versiunea 1.28.1) a fost utilizat pentru a efectua analiza expresiei diferențiale la nivel de genă RNA-seq. Bara orizontală de pe grafic reprezintă mediana. O valoare de semnificație de P = 0,05 a fost utilizată ca prag pentru toate testele.
Pentru mai multe informații despre designul studiului, consultați rezumatul Raportului de Cercetare Naturală, care face trimitere la acest articol.
Datele proteomice MS au fost depuse în ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) prin intermediul PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) cu identificatorul setului de date PXD032157.
Setul de date RNA-seq este depus în Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sub înregistrarea serială GSE198665.
Seturi de date suplimentare generate și/sau analizate în timpul studiului curent pot fi obținute de la autorii corespondenți, la cerere rezonabilă. Acest articol furnizează datele sursă.
De Loof, A. Ecdisteroide: Steroizi sexuali la insecte neglijați? Masculin: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroxiecdizonă și dezvoltarea ovariană la Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).
Data publicării: 08 iulie 2022