Acidul propionic (PPA), un agent antifungic și un aditiv alimentar comun, s-a dovedit a provoca o neurodezvoltare anormală la șoareci, însoțită de disfuncții gastrointestinale, care pot fi cauzate de disbioză intestinală. A fost sugerată o legătură între expunerea alimentară la PPA și disbioza microbiotei intestinale, dar nu a fost investigată direct. Aici, am investigat modificările asociate cu PPA în compoziția microbiotei intestinale, care pot duce la disbioză. Microbiomurile intestinale ale șoarecilor hrăniți cu o dietă netratată (n=9) și o dietă îmbogățită cu PPA (n=13) au fost secvențiate folosind secvențierea metagenomică pe termen lung pentru a evalua diferențele în compoziția microbiană și căile metabolice bacteriene. PPA alimentar a fost asociat cu o creștere a abundenței unor taxoni semnificativi, inclusiv mai multe specii de Bacteroides, Prevotella și Ruminococcus, membri ai căror membri au fost implicați anterior în producerea de PPA. Microbiomurile șoarecilor expuși la PPA au avut, de asemenea, mai multe căi legate de metabolismul lipidic și biosinteza hormonilor steroizi. Rezultatele noastre indică faptul că PPA poate altera microbiota intestinală și căile metabolice asociate acesteia. Aceste modificări observate evidențiază faptul că conservanții clasificați ca fiind siguri pentru consum pot influența compoziția microbiotei intestinale și, implicit, sănătatea umană. Dintre acestea, P, G sau S sunt selectate în funcție de nivelul de clasificare analizat. Pentru a minimiza impactul clasificărilor fals pozitive, a fost adoptat un prag minim de abundență relativă de 1e-4 (1/10.000 citiri). Înainte de analiza statistică, abundențele relative raportate de Bracken (fraction_total_reads) au fost transformate folosind transformarea logaritmică centrată (CLR) (Aitchison, 1982). Metoda CLR a fost aleasă pentru transformarea datelor deoarece este invariabilă la scară și suficientă pentru seturi de date non-rare (Gloor et al., 2017). Transformarea CLR utilizează logaritmul natural. Datele de numărare raportate de Bracken au fost normalizate folosind expresia logaritmică relativă (RLE) (Anders și Huber, 2010). Figurile au fost generate folosind o combinație de matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 și logaritmi secvențiali (Gloor et al., 2017). 0.12.2 și stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Raportul Bacillus/Bacteroidetes a fost calculat pentru fiecare probă folosind numărătoarea bacteriană normalizată. Valorile raportate în tabele sunt rotunjite la 4 zecimale. Indicele de diversitate Simpson a fost calculat folosind scriptul alpha_diversity.py furnizat în pachetul KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Raportul Bracken este furnizat în script, iar indicele Simpson „Si” este furnizat pentru parametrul -an. Diferențele semnificative în abundență au fost definite ca diferențe medii CLR ≥ 1 sau ≤ -1. O diferență medie CLR de ±1 indică o creștere de 2,7 ori a abundenței unui tip de probă. Semnul (+/-) indică dacă taxonul este mai abundent în proba PPA, respectiv în proba de control. Semnificația a fost determinată folosind testul Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). S-a utilizat Statsmodels v. 0.14 (Benjamini și Hochberg, 1995; Seabold și Perktold, 2010), iar procedura Benjamini-Hochberg a fost aplicată pentru corectarea testelor multiple. O valoare p ajustată ≤ 0,05 a fost utilizată ca prag pentru determinarea semnificației statistice.
Microbiomul uman este adesea denumit „ultimul organ al corpului” și joacă un rol vital în sănătatea umană (Baquero și Nombela, 2012). În special, microbiomul intestinal este recunoscut pentru influența sa la nivel de sistem și rolul său în multe funcții esențiale. Bacteriile comensale sunt abundente în intestin, ocupând multiple nișe ecologice, utilizând nutrienți și concurând cu potențiali agenți patogeni (Jandhyala și colab., 2015). Diverse componente bacteriene ale microbiotei intestinale sunt capabile să producă nutrienți esențiali, cum ar fi vitaminele, și să promoveze digestia (Rowland și colab., 2018). De asemenea, s-a demonstrat că metaboliții bacterieni influențează dezvoltarea țesuturilor și îmbunătățesc căile metabolice și imune (Heijtz și colab., 2011; Yu și colab., 2022). Compoziția microbiomului intestinal uman este extrem de diversă și depinde de factori genetici și de mediu, cum ar fi dieta, sexul, medicamentele și starea de sănătate (Kumbhare și colab., 2019).
Dieta maternă este o componentă critică a dezvoltării fetale și neonatale și o posibilă sursă de compuși care pot influența dezvoltarea (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Un astfel de compus de interes este acidul propionic (PPA), un produs secundar al acidului gras cu lanț scurt obținut din fermentația bacteriană și un aditiv alimentar (den Besten et al., 2013). PPA are proprietăți antibacteriene și antifungice și, prin urmare, este utilizat ca și conservant alimentar și în aplicații industriale pentru a inhiba creșterea mucegaiului și a bacteriilor (Wemmenhove et al., 2016). PPA are efecte diferite în diferite țesuturi. În ficat, PPA are efecte antiinflamatorii prin afectarea expresiei citokinelor în macrofage (Kawasoe et al., 2022). Acest efect de reglare a fost observat și în alte celule imune, ducând la reducerea inflamației (Haase et al., 2021). Cu toate acestea, efectul opus a fost observat în creier. Studiile anterioare au arătat că expunerea la PPA induce un comportament asemănător autismului la șoareci (El-Ansary și colab., 2012). Alte studii au arătat că PPA poate induce glioză și poate activa căile proinflamatorii din creier (Abdelli și colab., 2019). Deoarece PPA este un acid slab, acesta poate difuza prin epiteliul intestinal în fluxul sanguin și astfel poate traversa barierele restrictive, inclusiv bariera hematoencefalică, precum și placenta (Stinson și colab., 2019), subliniind importanța PPA ca metabolit reglator produs de bacterii. Deși rolul potențial al PPA ca factor de risc pentru autism este în prezent în curs de investigare, efectele sale asupra persoanelor cu autism se pot extinde dincolo de inducerea diferențierii neuronale.
Simptomele gastrointestinale, cum ar fi diareea și constipația, sunt frecvente la pacienții cu tulburări de neurodezvoltare (Cao et al., 2021). Studiile anterioare au arătat că microbiomul pacienților cu tulburări din spectrul autist (TSA) diferă de cel al persoanelor sănătoase, sugerând prezența disbiozei microbiotei intestinale (Finegold et al., 2010). În mod similar, caracteristicile microbiomului pacienților cu boli inflamatorii intestinale, obezitate, boala Alzheimer etc. diferă, de asemenea, de cele ale persoanelor sănătoase (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Cu toate acestea, până în prezent, nu a fost stabilită nicio relație cauzală între microbiomul intestinal și bolile sau simptomele neurologice (Yap et al., 2021), deși se consideră că mai multe specii bacteriene joacă un rol în unele dintre aceste stări de boală. De exemplu, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio și alte genuri sunt mai abundente în microbiota pacienților cu autism (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). În mod special, se știe că speciile membre ale unora dintre aceste genuri posedă gene asociate cu producerea de PPA (Reichardt et al., 2014; Yun și Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur și Dürre, 2023). Având în vedere proprietățile antimicrobiene ale PPA, creșterea abundenței sale poate fi benefică pentru creșterea bacteriilor producătoare de PPA (Jacobson et al., 2018). Astfel, un mediu bogat în PFA poate duce la modificări ale microbiotei intestinale, inclusiv la agenți patogeni gastrointestinali, care pot fi factori potențiali care duc la simptome gastrointestinale.
O întrebare centrală în cercetarea microbiomului este dacă diferențele în compoziția microbiană sunt o cauză sau un simptom al bolilor subiacente. Primul pas către elucidarea relației complexe dintre dietă, microbiomul intestinal și bolile neurologice este evaluarea efectelor dietei asupra compoziției microbiene. În acest scop, am utilizat secvențierea metagenomică de tip „long-read” pentru a compara microbiomele intestinale ale urmașilor șoarecilor hrăniți cu o dietă bogată în PPA sau cu o dietă săracă în PPA. Puii au fost hrăniți cu aceeași dietă ca și mamele lor. Am emis ipoteza că o dietă bogată în PPA ar duce la modificări ale compoziției microbiene intestinale și ale căilor funcționale microbiene, în special cele legate de metabolismul PPA și/sau producția de PPA.
Acest studiu a utilizat șoareci transgenici FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) care supraexprimă proteina fluorescentă verde (GFP) sub controlul promotorului GFAP specific gliei, urmând instrucțiunile Comitetului pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor din cadrul Universității din Florida Centrală (UCF-IACUC) (Număr permis de utilizare a animalelor: PROTO202000002). După înțărcare, șoarecii au fost adăpostiți individual în cuști, cu 1-5 șoareci din fiecare sex per cușcă. Șoarecii au fost hrăniți ad libitum fie cu o dietă de control purificată (dietă standard modificată, deschisă, 16 kcal% grăsimi), fie cu o dietă suplimentată cu propionat de sodiu (dietă standard modificată, deschisă, 16 kcal% grăsimi, conținând 5.000 ppm propionat de sodiu). Cantitatea de propionat de sodiu utilizată a fost echivalentă cu 5.000 mg PFA/kg greutate totală a alimentelor. Aceasta este cea mai mare concentrație de PPA aprobată pentru utilizare ca și conservant alimentar. Pentru a se pregăti pentru acest studiu, șoarecii părinți au fost hrăniți cu ambele diete timp de 4 săptămâni înainte de împerechere și au continuat pe tot parcursul gestației femelei. Șoarecii urmași [22 de șoareci, 9 loturi de control (6 masculi, 3 femele) și 13 șoareci PPA (4 masculi, 9 femele)] au fost înțărcați și apoi au continuat să urmeze aceeași dietă ca și femelele timp de 5 luni. Șoarecii urmași au fost sacrificați la vârsta de 5 luni, iar conținutul lor fecal intestinal a fost colectat și depozitat inițial în tuburi de microcentrifugă de 1,5 ml la -20°C și apoi transferați într-un congelator la -80°C până când ADN-ul gazdă a fost epuizat și acizii nucleici microbieni au fost extrași.
ADN-ul gazdă a fost îndepărtat conform unui protocol modificat (Charalampous et al., 2019). Pe scurt, conținutul fecal a fost transferat în 500 µl de InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) și depozitat congelat. Se procesează maximum 1-2 pelete fecale per extracție. Conținutul fecal a fost apoi omogenizat mecanic folosind un pistil din plastic în interiorul tubului pentru a forma o suspensie. Se centrifugă probele la 10.000 RCF timp de 5 minute sau până când probele s-au peletizat, apoi se aspiră supernatantul și se resuspendă peletul în 250 µl de 1× PBS. Se adaugă 250 µl de soluție de saponină 4,4% (TCI, număr produs S0019) în probă ca detergent pentru a slăbi membranele celulare eucariote. Probele au fost amestecate ușor până la omogenizare și incubate la temperatura camerei timp de 10 minute. Apoi, pentru a disrupa celulele eucariote, s-au adăugat la probă 350 μl de apă fără nucleaze, s-a incubat timp de 30 de secunde, apoi s-au adăugat 12 μl de NaCl 5 M. Probele au fost apoi centrifugate la 6000 RCF timp de 5 minute. Se aspiră supernatantul și se resuspenda peleta în 100 μl de PBS 1X. Pentru a îndepărta ADN-ul gazdă, se adaugă 100 μl de tampon HL-SAN (12,8568 g NaCl, 4 ml de MgCl2 1M, 36 ml de apă fără nucleaze) și 10 μl de enzimă HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Probele au fost amestecate bine prin pipetare și incubate la 37 °C timp de 30 de minute la 800 rpm pe un Eppendorf™ ThermoMixer C. După incubare, au fost centrifugate la 6000 RCF timp de 3 minute și spălate de două ori cu 800 µl și 1000 µl de PBS 1X. În final, peleta a fost resuspendată în 100 µl de PBS 1X.
ADN-ul bacterian total a fost izolat utilizând kitul de purificare a ADN-ului genomic New England Biolabs Monarch (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Procedura standard de operare furnizată împreună cu kitul este ușor modificată. Incubați și mențineți apă fără nucleaze la 60°C înainte de operare pentru eluția finală. Adăugați 10 µl de proteinază K și 3 µl de RNază A la fiecare probă. Apoi adăugați 100 µl de tampon de liză celulară și amestecați ușor. Probele au fost apoi incubate într-un Eppendorf™ ThermoMixer C la 56°C și 1400 rpm timp de cel puțin 1 oră și până la 3 ore. Probele incubate au fost centrifugate la 12.000 RCF timp de 3 minute, iar supernatantul din fiecare probă a fost transferat într-un tub de microcentrifugă separat de 1,5 ml conținând 400 µL de soluție de legare. Tuburile au fost apoi vortexate prin pulsare timp de 5-10 secunde la intervale de 1 secundă. Transferați întregul conținut lichid al fiecărei probe (aproximativ 600–700 µL) într-o cartușă de filtru plasată într-un tub de colectare cu flux continuu. Tuburile au fost centrifugate la 1.000 RCF timp de 3 minute pentru a permite legarea inițială a ADN-ului și apoi centrifugate la 12.000 RCF timp de 1 minut pentru a îndepărta lichidul rezidual. Coloana de probă a fost transferată într-un nou tub de colectare și apoi spălată de două ori. Pentru prima spălare, adăugați 500 µL de tampon de spălare în fiecare tub. Inversați tubul de 3-5 ori și apoi centrifugați la 12.000 RCF timp de 1 minut. Aruncați lichidul din tubul de colectare și plasați cartușul de filtru înapoi în același tub de colectare. Pentru a doua spălare, adăugați 500 µL de tampon de spălare în filtru fără a inversa. Probele au fost centrifugate la 12.000 RCF timp de 1 minut. Transferați filtrul într-un tub LoBind® de 1,5 ml și adăugați 100 µL de apă fără nucleaze preîncălzită. Filtrele au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 minut și apoi centrifugate la 12.000 RCF timp de 1 minut. ADN-ul eluat a fost păstrat la -80°C.
Concentrația de ADN a fost cuantificată utilizând un fluorometru Qubit™ 4.0. ADN-ul a fost preparat utilizând kitul Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (nr. cat. Q33231) conform instrucțiunilor producătorului. Distribuția lungimii fragmentelor de ADN a fost măsurată utilizând un dispozitiv TapeStation Aglient™ 4150 sau 4200. ADN-ul a fost preparat utilizând reactivii Agilent™ Genomic DNA Reagents (nr. cat. 5067-5366) și Genomic DNA ScreenTape (nr. cat. 5067-5365). Prepararea bibliotecii a fost efectuată utilizând kitul Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004), conform instrucțiunilor producătorului. ADN-ul a fost secvențiat utilizând un secvențiator ONT GridION™ Mk1 cu o celulă de flux Min106D (R 9.4.1). Setările de secvențiere au fost: apelarea bazei de înaltă precizie, valoarea q minimă de 9, configurarea codului de bare și ajustarea codului de bare. Probele au fost secvențiate timp de 72 de ore, după care datele apelurilor de bază au fost trimise pentru procesare și analiză ulterioară.
Prelucrarea bioinformatică a fost efectuată folosind metode descrise anterior (Greenman et al., 2024). Fișierele FASTQ obținute din secvențiere au fost împărțite în directoare pentru fiecare probă. Înainte de analiza bioinformatică, datele au fost procesate folosind următoarea metodă: mai întâi, fișierele FASTQ ale probelor au fost îmbinate într-un singur fișier FASTQ. Apoi, citirile mai scurte de 1000 bp au fost filtrate folosind Filtlong v. 0.2.1, singurul parametru modificat fiind –min_length 1000 (Wick, 2024). Înainte de filtrarea ulterioară, calitatea citirilor a fost controlată folosind NanoPlot v. 1.41.3 cu următorii parametri: –fastq –plots dot –N50 -o
Pentru clasificarea taxonomică, citirile și contigurile asamblate au fost clasificate folosind Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Generați rapoarte și fișiere de ieșire pentru citiri, respectiv asamblări. Utilizați opțiunea –use-names pentru a analiza citirile și asamblările. Opțiunile –gzip-compressed și –paired sunt specificate pentru segmentele de citire. Abundența relativă a taxonilor în metagenomi a fost estimată folosind Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Am creat mai întâi o bază de date kmer care conține 1000 de baze folosind bracken-build cu următorii parametri: -d
Adnotarea genelor și estimarea abundenței relative au fost efectuate folosind o versiune modificată a protocolului descris de Maranga și colab. (Maranga și colab., 2023). Mai întâi, contigurile mai mici de 500 pb au fost eliminate din toate ansamblurile folosind SeqKit v. 2.5.1 (Shen și colab., 2016). Ansamblurile selectate au fost apoi combinate într-un pan-metagenom. Cadrele de citire deschise (ORF) au fost identificate folosind Prodigal v. 1.0.1 (o versiune paralelă a Prodigal v. 2.6.3) cu următorii parametri: -d
Genele au fost grupate inițial conform identificatorilor ortologi (KO) din Enciclopedia Genelor și Genomului de la Kyoto (KEGG), atribuiți de eggNOG, pentru a compara abundențele căilor genice. Genele fără knockout-uri sau genele cu knockout-uri multiple au fost eliminate înainte de analiză. Abundența medie a fiecărui KO per probă a fost apoi calculată și s-a efectuat o analiză statistică. Genele metabolismului PPA au fost definite ca orice genă căreia i s-a atribuit un rând ko00640 în coloana KEGG_Pathway, indicând un rol în metabolismul propionatului conform KEGG. Genele identificate ca fiind asociate cu producția de PPA sunt enumerate în Tabelul suplimentar 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Testele de permutare au fost efectuate pentru a identifica genele metabolismului și producției de PPA care au fost semnificativ mai abundente în fiecare tip de probă. Au fost efectuate o mie de permutări pentru fiecare genă analizată. O valoare p de 0,05 a fost utilizată ca prag pentru a determina semnificația statistică. Adnotările funcționale au fost atribuite genelor individuale dintr-un cluster pe baza adnotărilor genelor reprezentative din cluster. Taxonii asociați cu metabolismul PPA și/sau producția de PPA au putut fi identificați prin potrivirea ID-urilor de contig din fișierele de ieșire Kraken2 cu aceleași ID-uri de contig păstrate în timpul adnotării funcționale folosind eggNOG. Testarea semnificației a fost efectuată folosind testul Mann-Whitney U descris anterior. Corecția pentru testarea multiplă a fost efectuată folosind procedura Benjamini-Hochberg. O valoare p de ≤ 0,05 a fost utilizată ca prag pentru a determina semnificația statistică.
Diversitatea microbiomului intestinal al șoarecilor a fost evaluată folosind indicele de diversitate Simpson. Nu s-au observat diferențe semnificative între probele de control și cele de PPA în ceea ce privește diversitatea genului și a speciilor (valoarea p pentru gen: 0,18, valoarea p pentru specie: 0,16) (Figura 1). Compoziția microbiană a fost apoi comparată folosind analiza componentelor principale (PCA). Figura 2 prezintă gruparea probelor în funcție de încrengăturile lor, indicând faptul că au existat diferențe în compoziția microbiomului pe specii între probele de PPA și cele de control. Această grupare a fost mai puțin pronunțată la nivel de gen, sugerând că PPA afectează anumite bacterii (Figura suplimentară 1).
Figura 1. Diversitatea alfa a genurilor și compoziția speciilor din microbiomul intestinal al șoarecilor. Diagrame tip box-diagram care prezintă indicii de diversitate Simpson ai genurilor (A) și speciilor (B) în probele PPA și de control. Semnificația a fost determinată folosind testul Mann-Whitney U, iar corecția multiplă a fost efectuată folosind procedura Benjamini-Hochberg. ns, valoarea p nu a fost semnificativă (p>0,05).
Figura 2. Rezultatele analizei componentelor principale a compoziției microbiomului intestinal al șoarecilor la nivel de specie. Graficul analizei componentelor principale afișează distribuția probelor pe primele două componente principale. Culorile indică tipul de probă: șoarecii expuși la PPA sunt violet, iar șoarecii de control sunt galbeni. Componentele principale 1 și 2 sunt reprezentate grafic pe axa x și respectiv axa y și sunt exprimate ca raportul lor de varianță explicat.
Folosind datele de numărare transformate prin RLE, s-a observat o scădere semnificativă a raportului median Bacteroidetes/Bacili la șoarecii de control și la șoarecii PPA (control: 9,66, PPA: 3,02; valoare p = 0,0011). Această diferență s-a datorat abundenței mai mari de Bacteroidetes la șoarecii PPA comparativ cu cei de control, deși diferența nu a fost semnificativă (CLR medie control: 5,51, CLR medie PPA: 6,62; valoare p = 0,054), în timp ce abundența Bacteroidetes a fost similară (CLR medie control: 7,76, CLR medie PPA: 7,60; valoare p = 0,18).
Analiza abundenței membrilor taxonomici ai microbiomului intestinal a relevat că 1 încrengătură și 77 de specii au diferit semnificativ între probele de PPA și cele de control (Tabelul suplimentar 2). Abundența a 59 de specii în probele de PPA a fost semnificativ mai mare decât cea din probele de control, în timp ce abundența a doar 16 specii în probele de control a fost mai mare decât cea din probele de PPA (Figura 3).
Figura 3. Abundența diferențială a taxonilor în microbiomul intestinal al șoarecilor PPA și de control. Diagramele vulcanice prezintă diferențe în abundența genurilor (A) sau speciilor (B) între probele PPA și de control. Punctele gri nu indică nicio diferență semnificativă în abundența taxonilor. Punctele colorate indică diferențe semnificative în abundență (valoarea p ≤ 0,05). Primii 20 de taxoni cu cele mai mari diferențe de abundență între tipurile de probe sunt arătați în roșu și albastru deschis (probe de control și PPA), respectiv. Punctele galbene și violet au fost de cel puțin 2,7 ori mai abundente în probele de control sau PPA decât în cele de control. Punctele negre reprezintă taxoni cu abundențe semnificativ diferite, cu diferențe medii CLR între -1 și 1. Valorile P au fost calculate folosind testul Mann-Whitney U și corectate pentru testarea multiplă folosind procedura Benjamini-Hochberg. Diferențele medii CLR îngroșate indică diferențe semnificative în abundență.
După analizarea compoziției microbiene intestinale, am efectuat o adnotare funcțională a microbiomului. După filtrarea genelor de calitate scăzută, au fost identificate un total de 378.355 de gene unice în toate probele. Abundența transformată a acestor gene a fost utilizată pentru analiza componentelor principale (PCA), iar rezultatele au arătat un grad ridicat de grupare a tipurilor de probe pe baza profilurilor lor funcționale (Figura 4).
Figura 4. Rezultatele PCA utilizând profilul funcțional al microbiomului intestinal al șoarecilor. Graficul PCA afișează distribuția probelor pe primele două componente principale. Culorile indică tipul de probă: șoarecii expuși la PPA sunt violet, iar șoarecii de control sunt galbeni. Componentele principale 1 și 2 sunt reprezentate grafic pe axa x și respectiv axa y și sunt exprimate ca raportul lor de varianță explicat.
În continuare, am examinat abundența genelor KEGG knockout în diferite tipuri de probe. Au fost identificate un total de 3648 de gene knockout unice, dintre care 196 au fost semnificativ mai abundente în probele de control și 106 au fost mai abundente în probele de PPA (Figura 5). Un total de 145 de gene au fost detectate în probele de control și 61 de gene în probele de PPA, cu abundențe semnificativ diferite. Căile legate de metabolismul lipidelor și aminozaharurilor au fost semnificativ mai îmbogățite în probele de PPA (Tabelul suplimentar 3). Căile legate de metabolismul azotului și sistemele de releu al sulfului au fost semnificativ mai îmbogățite în probele de control (Tabelul suplimentar 3). Abundența genelor legate de metabolismul aminozaharurilor/nucleotidelor (ko:K21279) și metabolismul fosfatului de inozitol (ko:K07291) a fost semnificativ mai mare în probele de PPA (Figura 5). Probele de control au avut semnificativ mai multe gene legate de metabolismul benzoatului (ko:K22270), metabolismul azotului (ko:K00368) și glicoliză/gluconeogeneză (ko:K00131) (Figura 5).
Fig. 5. Abundența diferențială a KO-urilor în microbiomul intestinal al șoarecilor PPA și de control. Diagrama vulcanului prezintă diferențele în abundența grupurilor funcționale (KO). Punctele gri indică KO-urile a căror abundență nu a fost semnificativ diferită între tipurile de probe (valoare p > 0,05). Punctele colorate indică diferențe semnificative în abundență (valoare p ≤ 0,05). Cele 20 de KO-uri cu cele mai mari diferențe de abundență între tipurile de probe sunt prezentate în roșu și albastru deschis, corespunzând probelor de control și respectiv PPA. Punctele galbene și violet indică KO-uri care au fost de cel puțin 2,7 ori mai abundente în probele de control și respectiv PPA. Punctele negre indică KO-uri cu abundențe semnificativ diferite, cu diferențe medii CLR între -1 și 1. Valorile P au fost calculate folosind testul Mann-Whitney U și ajustate pentru comparații multiple folosind procedura Benjamini-Hochberg. NaN indică faptul că KO-ul nu aparține unei căi în KEGG. Valorile medii ale diferenței CLR îngroșate indică diferențe semnificative în abundență. Pentru informații detaliate despre căile cărora le aparțin KO-urile enumerate, consultați tabelul suplimentar 3.
Printre genele adnotate, 1601 gene au avut abundențe semnificativ diferite între tipurile de probe (p ≤ 0,05), fiecare genă fiind de cel puțin 2,7 ori mai abundentă. Dintre aceste gene, 4 gene au fost mai abundente în probele de control, iar 1597 gene au fost mai abundente în probele de PPA. Deoarece PPA are proprietăți antimicrobiene, am examinat abundențele genelor de metabolism și producție a PPA între tipurile de probe. Printre cele 1332 de gene legate de metabolismul PPA, 27 de gene au fost semnificativ mai abundente în probele de control, iar 12 gene au fost mai abundente în probele de PPA. Printre cele 223 de gene legate de producția de PPA, 1 genă a fost semnificativ mai abundentă în probele de PPA. Figura 6A demonstrează în continuare abundența mai mare a genelor implicate în metabolismul PPA, cu o abundență semnificativ mai mare în probele de control și dimensiuni mari ale efectului, în timp ce Figura 6B evidențiază gene individuale cu abundență semnificativ mai mare observată în probele de PPA.
Fig. 6. Abundența diferențială a genelor legate de PPA în microbiomul intestinal al șoarecilor. Diagramele vulcanice prezintă diferențele în abundența genelor asociate cu metabolismul PPA (A) și producția de PPA (B). Punctele gri indică gene a căror abundență nu a fost semnificativ diferită între tipurile de probe (valoare p > 0,05). Punctele colorate indică diferențe semnificative în abundență (valoare p ≤ 0,05). Cele 20 de gene cu cele mai mari diferențe în abundență sunt prezentate în roșu și albastru deschis (probe de control și PPA), respectiv. Abundența punctelor galbene și violet a fost de cel puțin 2,7 ori mai mare în probele de control și PPA decât în probele de control. Punctele negre reprezintă gene cu abundențe semnificativ diferite, cu diferențe medii CLR între -1 și 1. Valorile P au fost calculate folosind testul Mann-Whitney U și corectate pentru comparații multiple folosind procedura Benjamini-Hochberg. Genele corespund genelor reprezentative din catalogul de gene neredundante. Numele genelor constau din simbolul KEGG care denotă o genă KO. Diferențele medii CLR scrise cu caractere aldine indică abundențe semnificativ diferite. O liniuță (-) indică faptul că nu există niciun simbol pentru genă în baza de date KEGG.
Taxonii cu gene legate de metabolismul și/sau producția de PPA au fost identificați prin potrivirea identității taxonomice a contigurilor cu ID-ul contigului genei. La nivel de gen, s-a constatat că 130 de genuri au gene legate de metabolismul PPA, iar 61 de genuri au gene legate de producția de PPA (Tabelul suplimentar 4). Cu toate acestea, niciun gen nu a prezentat diferențe semnificative în ceea ce privește abundența (p > 0,05).
La nivel de specie, s-a constatat că 144 de specii bacteriene au gene asociate cu metabolismul PPA și 68 de specii bacteriene au gene asociate cu producerea de PPA (Tabelul suplimentar 5). Printre metabolizatorii PPA, opt bacterii au prezentat creșteri semnificative ale abundenței între tipurile de probe și toate au prezentat modificări semnificative ale efectului (Tabelul suplimentar 6). Toți metabolizatorii PPA identificați cu diferențe semnificative în abundență au fost mai abundenți în probele de PPA. Clasificarea la nivel de specie a relevat reprezentanți ai unor genuri care nu au diferit semnificativ între tipurile de probe, inclusiv mai multe specii de Bacteroides și Ruminococcus, precum și Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus și Alcaligenes polymorpha. Printre bacteriile producătoare de PPA, patru bacterii au prezentat diferențe semnificative în abundență între tipurile de probe. Speciile cu diferențe semnificative în abundență au inclus Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis și Ruminococcus bovis.
În acest studiu, am examinat efectele expunerii la PPA asupra microbiotei intestinale a șoarecilor. PPA poate provoca răspunsuri diferite la bacterii, deoarece este produs de anumite specii, utilizat ca sursă de hrană de alte specii sau are efecte antimicrobiene. Prin urmare, adăugarea sa în mediul intestinal prin suplimentarea alimentară poate avea efecte diferite în funcție de toleranță, susceptibilitate și capacitatea de a-l utiliza ca sursă de nutrienți. Speciile bacteriene sensibile pot fi eliminate și înlocuite cu cele care sunt mai rezistente la PPA sau capabile să-l utilizeze ca sursă de hrană, ceea ce duce la modificări ale compoziției microbiotei intestinale. Rezultatele noastre au relevat diferențe semnificative în compoziția microbiană, dar niciun efect asupra diversității microbiene generale. Cele mai mari efecte au fost observate la nivel de specie, cu peste 70 de taxoni semnificativ diferiți în abundență între probele de PPA și cele de control (Tabelul suplimentar 2). Evaluarea ulterioară a compoziției probelor expuse la PPA a relevat o eterogenitate mai mare a speciilor microbiene în comparație cu probele neexpuse, sugerând că PPA poate îmbunătăți caracteristicile de creștere bacteriană și poate limita populațiile bacteriene care pot supraviețui în medii bogate în PPA. Astfel, PPA poate induce selectiv modificări, mai degrabă decât să provoace o perturbare pe scară largă a diversității microbiotei intestinale.
Conservanții alimentari, cum ar fi PPA, au demonstrat anterior că modifică abundența componentelor microbiomului intestinal fără a afecta diversitatea generală (Nagpal et al., 2021). Aici, am observat cele mai izbitoare diferențe între speciile de Bacteroidetes din cadrul încrengăturii Bacteroidetes (cunoscute anterior sub numele de Bacteroidetes), care au fost îmbogățite semnificativ la șoarecii expuși la PPA. Abundența crescută a speciilor de Bacteroides este asociată cu o degradare crescută a mucusului, ceea ce poate crește riscul de infecție și poate promova inflamația (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Un studiu a constatat că șoarecii masculi nou-născuți tratați cu Bacteroides fragilis au prezentat comportamente sociale care amintesc de tulburarea din spectrul autist (TSA) (Carmel et al., 2023), iar alte studii au arătat că speciile de Bacteroides pot altera activitatea imună și pot duce la cardiomiopatie inflamatorie autoimună (Gil-Cruz et al., 2019). Speciile aparținând genurilor Ruminococcus, Prevotella și Parabacteroides au fost, de asemenea, semnificativ crescute la șoarecii expuși la PPA (Coretti et al., 2018). Anumite specii de Ruminococcus sunt asociate cu boli precum boala Crohn prin producerea de citokine proinflamatorii (Henke et al., 2019), în timp ce speciile de Prevotella, cum ar fi Prevotella humani, sunt asociate cu boli metabolice precum hipertensiunea arterială și sensibilitatea la insulină (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). În cele din urmă, am constatat că raportul dintre Bacteroidetes (cunoscut anterior sub numele de Firmicutes) și Bacteroidetes a fost semnificativ mai mic la șoarecii expuși la PPA decât la șoarecii de control, datorită unei abundențe totale mai mari de specii de Bacteroidetes. Acest raport s-a dovedit anterior a fi un indicator important al homeostaziei intestinale, iar tulburările acestui raport au fost asociate cu diverse stări de boală (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), inclusiv boli inflamatorii intestinale (Stojanov et al., 2020). Colectiv, speciile din încrengătura Bacteroidetes par a fi cel mai puternic afectate de nivelurile ridicate de PPA din dietă. Acest lucru se poate datora unei toleranțe mai mari la PPA sau capacității de a utiliza PPA ca sursă de energie, ceea ce s-a dovedit a fi adevărat pentru cel puțin o specie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativ, expunerea maternă la PPA poate îmbunătăți dezvoltarea fetală prin creșterea susceptibilității intestinului puilor de șoarece la colonizarea cu Bacteroidetes; cu toate acestea, designul studiului nostru nu a permis o astfel de evaluare.
Evaluarea conținutului metagenomic a relevat diferențe semnificative în abundența genelor asociate cu metabolismul și producerea de PPA, șoarecii expuși la PPA prezentând o abundență mai mare de gene responsabile de producerea de PPA, în timp ce șoarecii neexpuși la PPA au prezentat o abundență mai mare de gene responsabile de metabolismul PAA (Figura 6). Aceste rezultate sugerează că efectul PPA asupra compoziției microbiene s-ar putea să nu se datoreze exclusiv utilizării sale, altfel abundența genelor asociate cu metabolismul PPA ar fi trebuit să prezinte o abundență mai mare în microbiomul intestinal al șoarecilor expuși la PPA. O explicație este că PPA mediază abundența bacteriană în principal prin efectele sale antimicrobiene, mai degrabă decât prin utilizarea sa de către bacterii ca nutrient. Studiile anterioare au arătat că PPA inhibă creșterea Salmonella Typhimurium într-un mod dependent de doză (Jacobson et al., 2018). Expunerea la concentrații mai mari de PPA poate selecta bacterii care sunt rezistente la proprietățile sale antimicrobiene și care nu sunt neapărat capabile să îl metabolizeze sau să îl producă. De exemplu, mai multe specii de Parabacteroides au prezentat o abundență semnificativ mai mare în probele de PPA, dar nu au fost detectate gene legate de metabolismul sau producția de PPA (Tabelele suplimentare 2, 4 și 5). În plus, producția de PPA ca produs secundar al fermentației este distribuită pe scară largă printre diverse bacterii (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Diversitatea bacteriană mai mare poate fi motivul abundenței mai mari de gene legate de metabolismul PPA în probele de control (Averina et al., 2020). În plus, doar 27 (2,14%) din 1332 de gene au fost prezise a fi gene asociate exclusiv cu metabolismul PPA. Multe gene asociate cu metabolismul PPA sunt implicate și în alte căi metabolice. Acest lucru demonstrează în continuare că abundența genelor implicate în metabolismul PPA a fost mai mare în probele de control; aceste gene pot funcționa pe căi care nu duc la utilizarea sau formarea PPA ca produs secundar. În acest caz, doar o genă asociată cu generarea de PPA a prezentat diferențe semnificative în abundență între tipurile de probe. Spre deosebire de genele asociate cu metabolismul PPA, genele marker pentru producerea de PPA au fost selectate deoarece sunt direct implicate în calea bacteriană pentru producerea de PPA. La șoarecii expuși la PPA, s-a constatat că toate speciile au o abundență și o capacitate semnificativ crescute de a produce PPA. Acest lucru susține predicția că PPA-urile ar selecta producătorii de PPA și, prin urmare, prevăd că capacitatea de producție de PPA ar crește. Cu toate acestea, abundența genelor nu se corelează neapărat cu expresia genelor; astfel, deși abundența genelor asociate cu metabolismul PPA este mai mare în probele de control, rata de expresie poate fi diferită (Shi et al., 2014). Pentru a confirma relația dintre prevalența genelor producătoare de PPA și producția de PPA, sunt necesare studii privind expresia genelor implicate în producerea de PPA.
Adnotarea funcțională a metagenomelor PPA și de control a relevat unele diferențe. Analiza PCA a conținutului genetic a relevat clustere discrete între probele PPA și cele de control (Figura 5). Gruparea în cadrul probei a relevat că a fost mai divers conținutul genelor de control, în timp ce probele PPA s-au grupat împreună. Gruparea după conținutul genelor a fost comparabilă cu gruparea după compoziția speciilor. Astfel, diferențele în abundența căilor de transmitere sunt în concordanță cu modificările abundenței speciilor și tulpinilor specifice din cadrul acestora. În probele PPA, două căi cu o abundență semnificativ mai mare au fost legate de metabolismul aminozaharurilor/nucleotidelor (ko:K21279) și de căi multiple ale metabolismului lipidic (ko:K00647, ko:K03801; Tabelul suplimentar 3). Genele asociate cu ko:K21279 sunt cunoscute ca fiind asociate cu genul Bacteroides, unul dintre genurile cu un număr semnificativ mai mare de specii în probele PPA. Această enzimă poate evita răspunsul imun prin exprimarea polizaharidelor capsulare (Wang et al., 2008). Acest lucru poate explica creșterea numărului de Bacteroidetes observată la șoarecii expuși la PPA. Aceasta completează sinteza crescută a acizilor grași observată în microbiomul PPA. Bacteriile utilizează calea FASIIko:K00647 (fabB) pentru a produce acizi grași, care pot influența căile metabolice ale gazdei (Yao și Rock, 2015; Johnson și colab., 2020), iar modificările metabolismului lipidic pot juca un rol în neurodezvoltare (Yu și colab., 2020). O altă cale care a prezentat o abundență crescută în probele de PPA a fost biosinteza hormonilor steroizi (ko:K12343). Există tot mai multe dovezi că există o relație inversă între capacitatea microbiotei intestinale de a influența nivelurile hormonale și de a fi influențată de hormoni, astfel încât nivelurile ridicate de steroizi pot avea consecințe asupra sănătății (Tetel și colab., 2018).
Acest studiu nu este lipsit de limitări și considerații. O distincție importantă este că nu am efectuat evaluări fiziologice ale animalelor. Prin urmare, nu este posibil să se concluzioneze direct dacă modificările microbiomului sunt asociate cu vreo boală. O altă considerație este că șoarecii din acest studiu au fost hrăniți cu aceeași dietă ca și mamele lor. Studiile viitoare ar putea determina dacă trecerea de la o dietă bogată în PPA la o dietă fără PPA îmbunătățește efectele acesteia asupra microbiomului. O limitare a studiului nostru, ca a multor altora, este dimensiunea limitată a eșantionului. Deși se pot trage concluzii valide, o dimensiune mai mare a eșantionului ar oferi o putere statistică mai mare la analiza rezultatelor. De asemenea, suntem precauți în ceea ce privește tragerea concluziilor despre o asociere între modificările microbiomului intestinal și orice boală (Yap et al., 2021). Factorii de confuzie, inclusiv vârsta, sexul și dieta, pot influența semnificativ compoziția microorganismelor. Acești factori pot explica inconsecvențele observate în literatura de specialitate cu privire la asocierea microbiomului intestinal cu boli complexe (Johnson et al., 2019; Lagod și Naser, 2023). De exemplu, s-a demonstrat că numărul membrilor genului Bacteroidetes este fie crescut, fie scăzut la animale și la oameni cu TSA (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). În mod similar, studiile privind compoziția intestinală la pacienții cu boli inflamatorii intestinale au constatat atât creșteri, cât și scăderi la aceiași taxoni (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Pentru a limita impactul prejudecăților de gen, am încercat să asigurăm o reprezentare egală a sexelor, astfel încât diferențele să fie cel mai probabil determinate de dietă. O provocare a adnotării funcționale este eliminarea secvențelor genetice redundante. Metoda noastră de grupare a genelor necesită o identitate a secvenței de 95% și o similaritate a lungimii de 85%, precum și o acoperire a alinierii de 90% pentru a elimina gruparea falsă. Cu toate acestea, în unele cazuri, am observat COG-uri cu aceleași adnotări (de exemplu, MUT) (Fig. 6). Sunt necesare studii suplimentare pentru a determina dacă acești ortologi sunt distincți, asociați cu genuri specifice sau dacă aceasta este o limitare a abordării de grupare a genelor. O altă limitare a adnotării funcționale este potențiala clasificare greșită; gena bacteriană mmdA este o enzimă cunoscută implicată în sinteza propionatului, dar KEGG nu o asociază cu calea metabolică a propionatului. În schimb, ortologii scpB și mmcD sunt înrudiți. Numărul mare de gene fără knockout-uri desemnate poate duce la incapacitatea de a identifica genele legate de PPA atunci când se evaluează abundența genelor. Studiile viitoare vor beneficia de analiza metatranscriptomului, care poate oferi o înțelegere mai profundă a caracteristicilor funcționale ale microbiotei intestinale și poate lega expresia genelor de potențialele efecte în aval. Pentru studiile care implică tulburări neurodezvoltării specifice sau boli inflamatorii intestinale, sunt necesare evaluări fiziologice și comportamentale ale animalelor pentru a lega modificările compoziției microbiomului de aceste tulburări. Studii suplimentare care transplantează microbiomul intestinal la șoareci fără germeni ar fi, de asemenea, utile pentru a determina dacă microbiomul este un factor determinant sau o caracteristică a bolii.
În concluzie, am demonstrat că PPA alimentar acționează ca un factor în modificarea compoziției microbiotei intestinale. PPA este un conservant aprobat de FDA, care se găsește pe scară largă în diverse alimente și care, la expunerea pe termen lung, poate duce la perturbarea florei intestinale normale. Am constatat modificări ale abundenței mai multor bacterii, ceea ce sugerează că PPA poate influența compoziția microbiotei intestinale. Modificările microbiotei pot duce la modificări ale nivelurilor anumitor căi metabolice, ceea ce poate duce la modificări fiziologice relevante pentru sănătatea gazdei. Sunt necesare studii suplimentare pentru a determina dacă efectele PPA alimentar asupra compoziției microbiene pot duce la disbioză sau la alte boli. Acest studiu pune bazele pentru studii viitoare privind modul în care efectele PPA asupra compoziției intestinale pot afecta sănătatea umană.
Seturile de date prezentate în acest studiu sunt disponibile în depozite online. Numele depozitului și numărul de acces sunt: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Acest studiu pe animale a fost aprobat de Comitetul pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor din cadrul Universității din Florida Centrală (UCF-IACUC) (Numărul permisului de utilizare a animalelor: PROTO202000002). Acest studiu respectă legile, reglementările și cerințele instituționale locale.
NG: Conceptualizare, Curatarea datelor, Analiză formală, Investigație, Metodologie, Software, Vizualizare, Scriere (cifră originală), Scriere (revizuire și editare). LA: Conceptualizare, Curatarea datelor, Metodologie, Resurse, Scriere (revizuire și editare). SH: Analiză formală, Software, Scriere (revizuire și editare). SA: Investigație, Scriere (revizuire și editare). Judecător-șef: Investigație, Scriere (revizuire și editare). SN: Conceptualizare, Administrarea proiectului, Resurse, Supervizare, Scriere (revizuire și editare). TA: Conceptualizare, Administrarea proiectului, Supervizare, Scriere (revizuire și editare).
Autorii declară că nu au primit niciun sprijin financiar pentru cercetarea, scrierea și/sau publicarea acestui articol.
Autorii declară că cercetarea a fost realizată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese. Nu se aplică.
Toate opiniile exprimate în acest articol aparțin exclusiv autorilor și nu reflectă neapărat opiniile instituțiilor, editorilor, editorilor sau recenzorilor lor. Produsele evaluate în acest articol sau afirmațiile făcute de producătorii acestora nu sunt garantate sau aprobate de editor.
Material suplimentar pentru acest articol poate fi găsit online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Acidul propionic induce glioză și neuroinflamație prin reglarea căii PTEN/AKT în tulburările din spectrul autist. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Analiza statistică a datelor compoziționale. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Raportul Firmicutes/Bacteroidetes ca factor de risc pentru cancerul de sân. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analiza expresiei diferențiale a datelor de numărare a secvențelor. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI și colab. (2013). Microbiota fecală și metabolomul la copiii cu autism și tulburare pervazivă de dezvoltare nespecificată altfel. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Caracteristici neurometabolice bacteriene ale microbiotei intestinale la copiii mici cu tulburări din spectrul autist. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Microbiomul ca organ uman. Microbiologie Clinică și Infecții 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Noi perspective asupra fiziologiei bacteriilor producătoare de acid propionic: Anaerotignum propionicum și Anaerotignum neopropionicum (fostele Clostridium propionicum și Clostridium neopropionicum). Microorganisme 11, 685. doi: 10.3390/microorganismes11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Nutriția mamei și dezvoltarea fătului. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. și Hochberg, J. (1995). Controlul ratei fals-pozitive: o abordare practică și eficientă a testării multiple. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Data publicării: 18 aprilie 2025