Metaboliții imunomodulatori sunt o caracteristică cheie a micromediului tumoral (TME), dar, cu câteva excepții, identitățile lor rămân în mare parte necunoscute. Aici, am analizat tumorile și celulele T din tumorile și ascita pacienților cu carcinom seros de grad înalt (HGSC) pentru a dezvălui metabolomul acestor compartimente diferite ale TME. Ascita și celulele tumorale prezintă diferențe extinse în ceea ce privește metaboliții. Comparativ cu ascita, celulele T care infiltrează tumora sunt semnificativ îmbogățite în 1-metilnicotinamidă (MNA). Deși nivelul de MNA în celulele T este crescut, expresia nicotinamid N-metiltransferazei (o enzimă care catalizează transferul grupărilor metil de la S-adenozilmetionină la nicotinamidă) este limitată la fibroblaste și celule tumorale. Funcțional, MNA induce celulele T să secrete citokina care promovează tumora, factorul de necroză tumorală alfa. Prin urmare, MNA derivat din TME contribuie la reglarea imună a celulelor T și reprezintă o potențială țintă de imunoterapie pentru tratamentul cancerului uman.
Metaboliții derivați din tumori pot avea un efect inhibitor profund asupra imunității antitumorale, iar tot mai multe dovezi arată că aceștia pot servi și ca o forță motrice cheie pentru progresia bolii (1). Pe lângă efectul Warburg, studii recente au început să caracterizeze starea metabolică a celulelor tumorale și relația acesteia cu starea imună a micromediului tumoral (TME). Studiile pe modele murine și celule T umane au arătat că metabolismul glutaminei (2), metabolismul oxidativ (3) și metabolismul glucozei (4) pot acționa independent asupra diferitelor subgrupuri de celule imune. Mai mulți metaboliți din aceste căi inhibă funcția antitumorală a celulelor T. S-a dovedit că blocarea coenzimei tetrahidrobiopterină (BH4) poate deteriora proliferarea celulelor T, iar creșterea BH4 în organism poate spori răspunsul imun antitumoral mediat de CD4 și CD8. În plus, efectul imunosupresor al kinureninei poate fi redresat prin administrarea de BH4 (5). În glioblastomul mutant al izocitrat dehidrogenază (IDH), secreția de (R)-2-hidroxiglutarat enantiometabolic (R-2-HG) inhibă activarea, proliferarea și activitatea citolizei celulelor T (6). Recent, s-a demonstrat că metilglioxalul, un produs secundar al glicolizei, este produs de celulele supresoare de origine mieloidă, iar transferul de metilglioxal către celulele T poate inhiba funcția celulelor T efectoare. În tratament, neutralizarea metilglioxalului poate depăși activitatea celulelor supresoare derivate din mieloide (MDSC) și poate spori sinergic terapia de blocare a punctelor de control la modelele murine (7). Aceste studii subliniază împreună rolul cheie al metaboliților derivați din TME în reglarea funcției și activității celulelor T.
Disfuncția celulelor T a fost raportată pe scară largă în cancerul ovarian (8). Acest lucru se datorează parțial caracteristicilor metabolice inerente hipoxiei și vascularizației tumorale anormale (9), care duc la conversia glucozei și triptofanului în subproduse precum acidul lactic și kinurenina. Lactatul extracelular excesiv reduce producția de interferon-γ (IFN-γ) și determină diferențierea subgrupurilor mielosupresoare (10, 11). Consumul de triptofan inhibă direct proliferarea celulelor T și inhibă semnalizarea receptorilor celulelor T (12-14). În ciuda acestor observații, s-au efectuat numeroase studii privind metabolismul imun în culturile de celule T in vitro, utilizând medii optimizate sau limitate la modele omoloage de șoareci in vivo, niciuna dintre acestea reflectând pe deplin heterogenitatea cancerelor umane și a macro și micromediului fiziologic.
O caracteristică comună a cancerului ovarian este răspândirea peritoneală și apariția ascitei. Acumularea de lichid celular în ascită este asociată cu boala avansată și un prognostic rezervat (15). Conform rapoartelor, acest compartiment unic este hipoxic, are niveluri ridicate de factor de creștere endotelial vascular (VEGF) și indoleamină 2,3-dioxigenază (IDO) și este infiltrat de celule T reglatoare și celule mieloide inhibitoare (15-18). Mediul metabolic al ascitei poate fi diferit de cel al tumorii în sine, astfel încât reprogramarea celulelor T în spațiul peritoneal este neclară. În plus, diferențele cheie și heterogenitatea dintre ascită și metaboliții prezenți în mediul tumoral pot împiedica infiltrarea celulelor imune și funcția acestora asupra tumorilor, fiind necesare cercetări suplimentare.
Pentru a rezolva aceste probleme, am conceput o metodă sensibilă de separare celulară și spectrometrie de masă în tandem cu cromatografie lichidă (LC-MS/MS) pentru a studia diferite tipuri de celule (inclusiv celulele T CD4+ și CD8+), precum și în interiorul și între tumori. Metaboliții săi se întind pe celule din același mediu de ascită și tumoră ca pacientul. Folosim această metodă împreună cu citometria în flux de înaltă dimensiune și secvențierea ARN unicelulară (scRNA-seq) pentru a oferi un portret cu rezoluție înaltă a stării metabolice a acestor populații cheie. Această metodă a relevat o creștere semnificativă a nivelului de 1-metilnicotinamidă (MNA) în celulele T tumorale, iar experimentele in vitro au arătat că efectul imunomodulator al MNA asupra funcției celulelor T era necunoscut anterior. În general, această metodă relevă interacțiunile metabolice reciproce dintre tumori și celulele imune și oferă perspective unice asupra metaboliților de reglare imună, care pot fi utile pentru tratamentul imunoterapiei cancerului ovarian bazate pe celule T. Oportunități de tratament.
Am utilizat citometria în flux de înaltă dimensiune pentru a cuantifica simultan absorbția de glucoză [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoxiglucoza (2-NBDG) și activitatea mitocondrială [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) sunt markeri tipici care disting celulele imune de populațiile de celule tumorale (Tabelul S2 și Figura S1A). Această analiză a arătat că, în comparație cu celulele T, ascita și celulele tumorale au niveluri mai ridicate de absorbție a glucozei, dar prezintă diferențe mai mici în activitatea mitocondrială. Absorbția medie de glucoză a celulelor tumorale [CD45-EpCAM (EpCAM)+] este de trei până la patru ori mai mare decât cea a celulelor T, iar absorbția medie de glucoză a celulelor T CD4+ este de 1,2 ori mai mare decât cea a celulelor T CD8+, ceea ce indică faptul că limfocitele infiltrante tumorale (TIL) au cerințe metabolice diferite chiar și în același TME (Figura 1A). În schimb, activitatea mitocondrială din celulele tumorale este similară cu cea a celulelor T CD4+, iar activitatea mitocondrială a ambelor tipuri de celule este mai mare decât cea a celulelor T CD8+ (Figura 1B). În general, aceste rezultate dezvăluie nivelul metabolic. Activitatea metabolică a celulelor tumorale este mai mare decât cea a celulelor T CD4+, iar activitatea metabolică a celulelor T CD4+ este mai mare decât cea a celulelor T CD8+. În ciuda acestor efecte între tipurile de celule, nu există o diferență consistentă în starea metabolică a celulelor T CD4+ și CD8+ sau în proporțiile lor relative în ascită comparativ cu tumorile (Figura 1C). În schimb, în ​​fracțiunea de celule CD45, proporția de celule EpCAM+ din tumoră a crescut în comparație cu ascita (Figura 1D). De asemenea, am observat o diferență metabolică clară între componentele celulelor EpCAM+ și EpCAM-. Celulele EpCAM+ (tumorale) au o absorbție a glucozei și o activitate mitocondrială mai mari decât celulele EpCAM-, ceea ce este mult mai mare decât activitatea metabolică a fibroblastelor din celulele tumorale din TME (Figura 1, E și F).
(A și B) Intensitatea mediană a fluorescenței (MFI) a absorbției de glucoză (2-NBDG) (A) și activitatea mitocondrială a celulelor T CD4+ (MitoTracker roșu închis) (B) Grafice reprezentative (stânga) și date tabelare (dreapta), celule T CD8+ și celule tumorale EpCAM+ CD45 din ascită și tumoră. (C) Raportul dintre celulele CD4+ și CD8+ (din celulele T CD3+) în ascită și tumoră. (D) Proporția de celule tumorale EpCAM+ în ascită și tumoră (CD45−). (E și F) Absorbția de glucoză EpCAM+ CD45-tumoară și EpCAM-CD45-matrice (2-NBDG) (E) și activitatea mitocondrială (MitoTracker roșu închis) (F) Grafice reprezentative (stânga) și date tabelare (dreapta) Ascite și celule tumorale. (G) Grafice reprezentative ale expresiei CD25, CD137 și PD1 prin citometrie în flux. (H și I) Expresia CD25, CD137 și PD1 pe celulele T CD4+ (H) și celulele T CD8+ (I). (J și K) Fenotipuri naive, cu memorie centrală (Tcm), efectoare (Teff) și cu memorie efectoare (Tem) bazate pe expresia CCR7 și CD45RO. Imagini reprezentative (stânga) și date tabelare (dreapta) ale celulelor T CD4+ (J) și celulelor T CD8+ (K) în ascită și tumori. Valorile P determinate prin testul t pereche (*P<0,05, **P<0,01 și ***P<0,001). Linia reprezintă pacienții potriviți (n = 6). FMO, fluorescență minus unu; MFI, intensitatea mediană a fluorescenței.
Analize ulterioare au relevat alte diferențe semnificative între statusul fenotipic al celulelor T, cu rezoluție înaltă. Tulburările de activare (Figura 1, G până la I) și memoria efectoare (Figura 1, J și K) în tumori sunt mult mai frecvente decât în ​​ascita (proporția de celule T CD3+). În mod similar, analiza fenotipului prin expresia markerilor de activare (CD25 și CD137) și a markerilor de depleție [proteina 1 a morții celulare programate (PD1)] a arătat că, deși caracteristicile metabolice ale acestor populații sunt diferite (Figura S1, B până la E), nu s-au observat în mod constant diferențe metabolice semnificative între subseturile naive, efectoare sau de memorie (Figura S1, F până la I). ​​Aceste rezultate au fost confirmate prin utilizarea metodelor de învățare automată pentru atribuirea automată a fenotipurilor celulare (21), ceea ce a relevat în continuare prezența unui număr mare de celule din măduva osoasă (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) în ascita pacientului (Figura S2A). Dintre toate tipurile de celule identificate, această populație de celule mieloide a prezentat cea mai mare absorbție de glucoză și activitate mitocondrială (Figura S2, B până la G). Aceste rezultate evidențiază diferențele metabolice puternice dintre multiplele tipuri de celule găsite în ascită și tumori la pacienții cu HGSC.
Principala provocare în înțelegerea caracteristicilor metabonomice ale TIL este necesitatea izolării probelor de celule T de puritate, calitate și cantitate suficiente din tumori. Studii recente au arătat că metodele de sortare și îmbogățire cu sfere bazate pe citometrie în flux pot duce la modificări ale profilurilor metaboliților celulari (22-24). Pentru a depăși această problemă, am optimizat metoda de îmbogățire cu sfere pentru a izola TIL din cancerul ovarian uman rezecat chirurgical înainte de analiza prin LC-MS/MS (vezi Materiale și metode; Figura 2A). Pentru a evalua impactul general al acestui protocol asupra modificărilor metaboliților, am comparat profilurile metaboliților celulelor T activate de donatorii sănătoși după etapa de separare a sferelor de mai sus cu celule care nu au fost separate cu sfere, ci au rămas pe gheață. Această analiză de control al calității a constatat că există o corelație ridicată între aceste două condiții (r = 0,77), iar repetabilitatea tehnică a grupului de 86 de metaboliți are o repetabilitate ridicată (Figura 2B). Prin urmare, aceste metode pot efectua analize precise ale metaboliților în celulele supuse îmbogățirii tipurilor celulare, oferind astfel prima platformă de înaltă rezoluție pentru identificarea metaboliților specifici în HGSC, permițând astfel oamenilor să dobândească o înțelegere mai profundă a specificității celulare a programului de metabolism sexual.
(A) Diagramă schematică a îmbogățirii cu sfere magnetice. Înainte de analiza prin LC-MS/MS, celulele vor fi supuse a trei runde consecutive de îmbogățire cu sfere magnetice sau vor rămâne pe gheață. (B) Efectul tipului de îmbogățire asupra abundenței metaboliților. Media a trei măsurători pentru fiecare tip de îmbogățire ± SE. Linia gri reprezintă o relație 1:1. Corelația intra-clasă (ICC) a măsurătorilor repetate este prezentată în eticheta axei. NAD, nicotinamid adenin dinucleotidă. (C) Diagramă schematică a fluxului de lucru al analizei metaboliților pacientului. Ascita sau tumorile sunt colectate de la pacienți și crioconservate. O mică porțiune din fiecare probă a fost analizată prin citometrie în flux, în timp ce probele rămase au fost supuse a trei runde de îmbogățire pentru celulele CD4+, CD8+ și CD45-. Aceste fracții celulare au fost analizate utilizând LC-MS/MS. (D) Hartă termică a abundenței standardizate a metaboliților. Dendrograma reprezintă gruparea Ward a distanțelor euclidiene dintre probe. (E) Analiza componentelor principale (PCA) a hărții metaboliților eșantionului, prezentând trei replici ale fiecărei probe, probele de la același pacient fiind conectate printr-o linie. (F) PCA a profilului metaboliților eșantionului condiționat pe pacient (adică, utilizând redundanță parțială); tipul de probă este limitat de învelișul convex. PC1, componenta principală 1; PC2, componenta principală 2.
În continuare, am aplicat această metodă de îmbogățire pentru a analiza 99 de metaboliți din fracțiunile de celule CD4+, CD8+ și CD45- din ascita primară și tumorile la șase pacienți cu HGSC (Figura 2C, Figura S3A și Tabelul S3 și S4). Populația de interes reprezintă 2% până la 70% din eșantionul inițial mare de celule vii, iar proporția de celule variază foarte mult între pacienți. După separarea perlelor, fracțiunea îmbogățită de interes (CD4+, CD8+ sau CD45-) reprezintă în medie peste 85% din totalul celulelor vii din eșantion. Această metodă de îmbogățire ne permite să analizăm populațiile de celule din metabolismul țesutului tumoral uman, ceea ce este imposibil de făcut din probe mari. Folosind acest protocol, am stabilit că l-kinurenina și adenozina, acești doi metaboliți imunosupresori bine caracterizați, au fost crescuți în celulele T tumorale sau în celulele tumorale (Figura S3, B și C). Prin urmare, aceste rezultate demonstrează fidelitatea și capacitatea tehnologiei noastre de separare celulară și spectrometrie de masă de a găsi metaboliți importanți din punct de vedere biologic în țesuturile pacienților.
Analiza noastră a relevat, de asemenea, o separare metabolică puternică a tipurilor de celule în cadrul pacienților și între aceștia (Figura 2D și Figura S4A). În special, comparativ cu alți pacienți, pacientul 70 a prezentat caracteristici metabolice diferite (Figura 2E și Figura S4B), indicând faptul că poate exista o eterogenitate metabolică substanțială între pacienți. Este demn de remarcat faptul că, comparativ cu alți pacienți (1,2 până la 2 litri; Tabelul S1), cantitatea totală de ascită colectată la pacientul 70 (80 ml) a fost mai mică. Controlul eterogenității inter-pacienți în timpul analizei componentelor principale (de exemplu, utilizând analiza de redundanță parțială) arată modificări consistente între tipurile de celule, iar tipurile de celule și/sau micromediul sunt clar agregate în funcție de profilul metaboliților (Figura 2F). Analiza metaboliților individuali a subliniat aceste efecte și a relevat diferențe semnificative între tipurile de celule și micromediu. Este demn de remarcat faptul că cea mai extremă diferență observată este MNA, care este de obicei îmbogățit în celule CD45- și în celule CD4+ și CD8+ care infiltrează tumora (Figura 3A). Pentru celulele CD4+, acest efect este cel mai evident, iar MNA din celulele CD8+ pare să fie, de asemenea, puternic afectat de mediu. Cu toate acestea, acest lucru nu este important, deoarece doar trei dintre cei șase pacienți pot fi evaluați pentru scorurile CD8+ tumorale. Pe lângă MNA, în diferite tipuri de celule din ascită și tumori, alți metaboliți care sunt slab caracterizați în TIL sunt, de asemenea, bogați diferențiat (Figurile S3 și S4). Prin urmare, aceste date dezvăluie un set promițător de metaboliți imunomodulatori pentru cercetări suplimentare.
(A) Conținut normalizat de MNA în celulele CD4+, CD8+ și CD45- din ascită și tumoră. Diagrama tip box plot prezintă mediana (linia), intervalul intercuartil (balansa cadrului) și intervalul de date, până la 1,5 ori intervalul intercuartil (mustața cadrului). Așa cum este descris în Materiale și metode pentru pacienți, utilizați valoarea limma a pacientului pentru a determina valoarea P (*P<0,05 și **P<0,01). (B) Diagramă schematică a metabolismului MNA (60). Metaboliți: S-adenozil-1-metionină; SAH, S-adenozin-1-homocisteină; NA, nicotinamidă; MNA, 1-metilnicotinamidă; 2-PY, 1-metil-2-piridonă-5-carboxamidă; 4-PY, 1-metil-4-piridonă-5-carboxamidă; NR, nicotinamidă riboză; NMN, nicotinamidă mononucleotidă. Enzime (verde): NNMT, nicotinamid N-metiltransferază; SIRT, sirtuine; NAMPT, nicotinamid fosforibozil transferază; AOX1, aldehid oxidază 1; NRK, nicotinamid ribozid kinază; NMNAT, nicotinamid mononucleotid adenilat transferază; Pnp1, purin nucleozid fosforilază. (C) t-SNE al scRNA-seq al ascitei (gri) și tumorii (roșu; n = 3 pacienți). (D) Expresia NNMT în diferite populații celulare identificate folosind scRNA-seq. (E) Expresia NNMT și AOX1 în SK-OV-3, rinichi embrionar uman (HEK) 293T, celule T și celule T tratate cu MNA. Expresia pliată este prezentată în raport cu SK-OV-3. Este prezentat modelul de expresie cu SEM (n = 6 donatori sănătoși). Valorile Ct mai mari de 35 sunt considerate nedetectabile (UD). (F) Expresia SLC22A1 și SLC22A2 în celulele SK-OV-3, HEK293T, celulele T și celulele T tratate cu 8 mM MNA. Expresia pliată este prezentată în raport cu SK-OV-3. Este prezentat modelul de expresie cu SEM (n = 6 donatori sănătoși). Valorile Ct mai mari de 35 sunt considerate nedetectabile (UD). (G) Conținutul celular de MNA în celulele T donatoare sănătoase activate după 72 de ore de incubare cu MNA. Este prezentat modelul de expresie cu SEM (n = 4 donatori sănătoși).
MNA este produs prin transferul grupării metil de la S-adenozil-1-metionină (SAM) la nicotinamidă (NA) prin intermediul nicotinamid N-metiltransferază (NNMT; Figura 3B). NNMT este supraexprimat într-o varietate de tipuri de cancer uman și este asociat cu proliferarea, invazia și metastaza (25-27). Pentru a înțelege mai bine sursa MNA în celulele T în TME, am utilizat scRNA-seq pentru a caracteriza expresia NNMT în diferite tipuri de celule din ascita și tumorile a trei pacienți cu HGSC (Tabelul S5). Analiza a aproximativ 6.500 de celule a arătat că în mediile cu ascită și tumoră, expresia NNMT a fost limitată la populațiile presupuse de fibroblaste și celule tumorale (Figura 3, C și D). Este demn de remarcat faptul că nu există o expresie evidentă a NNMT în nicio populație care exprimă PTPRC (CD45+) (Figura 3D și Figura S5A), ceea ce indică faptul că MNA detectat în spectrul metabolitului a fost introdus în celulele T. Expresia aldehidoxidazei 1 (AOX1) transformă MNA în 1-metil-2-piridon-5-carboxamidă (2-PYR) sau 1-metil-4-piridon-5-carboxamidă (4-PYR); Figura 3B) este, de asemenea, limitată la populația de fibroblaste care exprimă COL1A1 (Figura S5A), ceea ce împreună indică faptul că celulele T nu au capacitatea metabolismului convențional al MNA. Modelul de expresie al acestor gene legate de MNA a fost verificat utilizând un al doilea set independent de date celulare din ascită de la pacienți cu HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). În plus, analiza cantitativă a reacției în lanț a polimerazei (qPCR) a celulelor T donatoare sănătoase tratate cu MNA a arătat că, în comparație cu celulele tumorale ovariene SK-OV-3 de control, NNMT sau AOX1 aproape că nu au fost exprimate (Figura 3E). Aceste rezultate neașteptate indică faptul că MNA poate fi secretat din fibroblaste sau tumori în celulele T adiacente în TME.
Deși printre candidați se numără familia de transportori de cationi organici 1 până la 3 (OCT1, OCT2 și OCT3) codificați de familia de transportori solubili 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 și SLC22A3), potențialii transportori de MNA sunt încă nedefiniți (28). QPCR-ul ARNm din celulele T donatoare sănătoase a arătat niveluri scăzute de expresie a SLC22A1, dar niveluri nedetectabile de SLC22A2, ceea ce a confirmat că acest lucru fusese raportat anterior în literatura de specialitate (Figura 3F) (29). În schimb, linia celulară tumorală ovariană SK-OV-3 a exprimat niveluri ridicate ale ambilor transportori (Figura 3F).
Pentru a testa posibilitatea ca celulele T să aibă capacitatea de a absorbi MNA străin, celule T donatoare sănătoase au fost cultivate timp de 72 de ore în prezența a diferite concentrații de MNA. În absența MNA exogen, conținutul celular de MNA nu poate fi detectat (Figura 3G). Cu toate acestea, celulele T activate tratate cu MNA exogen au prezentat o creștere dependentă de doză a conținutului de MNA în celule, până la 6 mM MNA (Figura 3G). Acest rezultat indică faptul că, în ciuda nivelului scăzut de expresie a transportorilor și a lipsei principalei enzime responsabilă de metabolismul intracelular al MNA, TIL poate totuși absorbi MNA.
Spectrul metaboliților din celulele T ale pacienților și experimentele in vitro de absorbție a MNA cresc posibilitatea ca fibroblastele asociate cancerului (CAF) să secrete MNA, iar celulele tumorale să regleze fenotipul și funcția TIL. Pentru a determina efectul MNA asupra celulelor T, celulele T donatoare sănătoase au fost activate in vitro în prezența sau absența MNA, iar proliferarea și producția lor de citokine au fost evaluate. După 7 zile de adăugare de MNA la cea mai mare doză, numărul de dublare a populației a fost redus moderat, în timp ce vigoarea a fost menținută la toate dozele (Figura 4A). În plus, tratamentul cu MNA exogen a dus la o creștere a proporției de celule T CD4+ și CD8+ care exprimă factorul de necroză tumorală-α (TNFα; Figura 4B). În schimb, producția intracelulară de IFN-γ a fost redusă semnificativ în celulele T CD4+, dar nu și în celulele T CD8+ și nu a existat nicio modificare semnificativă a interleukinei 2 (IL-2; Figura 4, C și D). Prin urmare, testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) al supernatantelor din aceste culturi de celule T tratate cu MNA a arătat o creștere semnificativă a TNFα, o scădere a IFN-γ și nicio modificare a IL-2 (Figura 4, E până la G). Scăderea IFN-γ indică faptul că MNA poate juca un rol în inhibarea activității antitumorale a celulelor T. Pentru a simula efectul MNA asupra citotoxicității mediate de celulele T, celulele receptorului T al antigenului himeric (FRα-CAR-T) care vizează receptorul α al folatului și celulele CAR-T (GFP) reglate de proteina fluorescentă verde (GFP) -CAR-T sunt produse de celule mononucleare din sângele periferic (PBMC) din donatori sănătoși. Celulele CAR-T au fost cultivate timp de 24 de ore în prezența MNA și apoi co-cultivate cu celule tumorale ovariene umane SK-OV-3 care exprimă receptorul α al folatului la un raport efector-țintă de 10:1. Tratamentul cu MNA a dus la o scădere semnificativă a activității de ucidere a celulelor FRα-CAR-T, similară cu cea a celulelor FRα-CAR-T tratate cu adenozină (Figura 4H).
(A) Numărul total de celule viabile și dublarea populației (PD) direct din cultură în ziua 7. Graficul cu bare reprezintă media + SEM a șase donatori sănătoși. Reprezintă date din cel puțin n = 3 experimente independente. (B până la D) CD3/CD28 și IL-2 au fost utilizate pentru a activa celulele T la concentrațiile lor respective de MNA timp de 7 zile. Înainte de analiză, celulele au fost stimulate cu PMA/ionomicină cu GolgiStop timp de 4 ore. Expresia TNFα (B) în celulele T. Imagine exemplu (stânga) și date tabelare (dreapta) ale expresiei TNFα în celulele vii. Expresia IFN-γ (C) și IL-2 (D) în celulele T. Expresia citokinelor a fost măsurată prin citometrie în flux. Graficul cu bare reprezintă media (n = 6 donatori sănătoși) + SEM. Se utilizează analiza varianței unidirecționale și măsurători repetate (*P<0,05 și **P<0,01) pentru a determina valoarea P. Reprezintă date din cel puțin n = 3 experimente independente. (E până la G) CD3/CD28 și IL-2 au fost utilizate pentru a activa celulele T la concentrațiile lor respective de MNA timp de 7 zile. Mediul a fost colectat înainte și după 4 ore de stimulare cu PMA/ionomicină. Concentrațiile de TNFα (E), IFN-γ (F) și IL-2 (G) au fost măsurate prin ELISA. Graficul cu bare reprezintă media (n = 5 donatori sănătoși) + SEM. Valoarea P determinată folosind analiza varianței într-o singură direcție și măsurători repetate (*P<0,05). Linia punctată indică limita de detecție a detecției. (H) Test de liză celulară. Celulele FRα-CAR-T sau GFP-CAR-T au fost ajustate cu adenozină (250 μM) sau MNA (10 mM) timp de 24 de ore sau lăsate netratate (Ctrl). Procentul de ucidere a celulelor SK-OV-3 a fost măsurat. Valoarea P determinată prin testul Welch t (*P<0,5 și **P<0,01).
Pentru a obține o înțelegere mecanistică a reglării expresiei TNFα dependente de MNA, au fost evaluate modificările din ARNm-ul TNFα al celulelor T tratate cu MNA (Figura 5A). Celulele T donatoare sănătoase tratate cu MNA au prezentat o creștere de două ori a nivelurilor de transcripție TNFα, indicând faptul că MNA este dependent de reglarea transcripțională a TNFα. Pentru a investiga acest posibil mecanism de reglare, doi factori de transcripție cunoscuți care reglează TNFα, și anume factorul nuclear al celulelor T activate (NFAT) și proteina specifică 1 (Sp1), au fost evaluați ca răspuns la legarea MNA la promotorul TNFα proximal (30). Promotorul TNFα conține 6 situsuri de legare NFAT identificate și 2 situsuri de legare Sp1, care se suprapun la un situs [-55 perechi de baze (pb) de la capacul 5'] (30). Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) a arătat că, atunci când este tratată cu MNA, legarea Sp1 la promotorul TNFα a crescut de trei ori. Încorporarea NFAT a crescut, de asemenea, și a apropiat importanța (Figura 5B). Aceste date indică faptul că MNA reglează expresia TNFα prin transcripția Sp1 și, într-o măsură mai mică, expresia NFAT.
(A) Comparativ cu celulele T cultivate fără MNA, este prezentat modelul de expresie cu SEM (n = 5 donatori sănătoși). Reprezintă date din cel puțin n = 3 experimente independente. (B) Promotorul TNFα al celulelor T tratate cu sau fără 8 mM MNA după ce NFAT și Sp1 au fost combinate cu stimulare (Ctrl) și PMA/ionomicină timp de 4 ore. Imunoglobulina G (IgG) și H3 au fost utilizate ca și controale negative, respectiv pozitive pentru imunoprecipitare. Cuantificarea ChIP a arătat că legarea Sp1 și NFAT la promotorul TNFα în celulele tratate cu MNA a crescut de câteva ori în comparație cu controlul. Reprezintă date din cel puțin n = 3 experimente independente. Valoarea P determinată prin teste t multiple (*** P <0,01). (C) Comparativ cu ascita HGSC, celulele T (necitotoxice) au prezentat o expresie crescută a TNF în tumoră. Culorile reprezintă diferiți pacienți. Celulele afișate au fost eșantionate aleatoriu până la 300 și modificate prin jitter pentru a limita supraexprimarea (** Padj = 0,0076). (D) Model propus de MNA pentru cancerul ovarian. MNA este produs în celulele tumorale și fibroblaste din TME și este absorbit de celulele T. MNA crește legarea Sp1 la promotorul TNFα, ducând la creșterea transcripției TNFα și a producției de citokine TNFα. MNA provoacă, de asemenea, o scădere a IFN-γ. Inhibarea funcției celulelor T duce la reducerea capacității de ucidere și la accelerarea creșterii tumorii.
Conform rapoartelor, TNFα are efecte antitumorale și antitumorale front-back-dependente, dar are un rol binecunoscut în promovarea creșterii și metastazelor cancerului ovarian (31-33). Conform rapoartelor, concentrația de TNFα în ascită și țesuturile tumorale la pacienții cu cancer ovarian este mai mare decât cea din țesuturile benigne (34-36). În ceea ce privește mecanismul, TNFα poate regla activarea, funcția și proliferarea leucocitelor și poate modifica fenotipul celulelor canceroase (37, 38). În concordanță cu aceste descoperiri, analiza expresiei genice diferențiale a arătat că TNF a fost semnificativ suprareglat în celulele T din țesuturile tumorale în comparație cu ascita (Figura 5C). Creșterea expresiei TNF a fost evidentă doar în populațiile de celule T cu un fenotip non-citotoxic (Figura S5A). În concluzie, aceste date susțin opinia că MNA are efecte duble imunosupresoare și de promovare tumorală în HGSC.
Marcarea fluorescentă bazată pe citometrie în flux a devenit principala metodă de studiere a metabolismului TIL. Aceste studii au arătat că, în comparație cu limfocitele din sângele periferic sau celulele T din organele limfoide secundare, TIL murin și uman au o tendință mai mare de a absorbi glucoză (4, 39) și pierderea treptată a funcției mitocondriale (19, 40). Deși am observat rezultate similare în acest studiu, dezvoltarea cheie este compararea metabolismului celulelor tumorale și TIL din același țesut tumoral rezecat. În concordanță cu unele dintre aceste rapoarte anterioare, celulele tumorale (CD45-EpCAM+) din ascită și tumori au o absorbție mai mare a glucozei decât celulele T CD8+ și CD4+, susținând că absorbția ridicată a glucozei de către celulele tumorale poate fi comparată cu cea a celulelor T. Conceptul de competiție a celulelor T. TME. Cu toate acestea, activitatea mitocondrială a celulelor tumorale este mai mare decât cea a celulelor T CD8+, dar activitatea mitocondrială este similară cu cea a celulelor T CD4+. Aceste rezultate întăresc tema emergentă conform căreia metabolismul oxidativ este important pentru celulele tumorale (41, 42). De asemenea, acestea sugerează că celulele T CD8+ pot fi mai susceptibile la disfuncții oxidative decât celulele T CD4+ sau că celulele T CD4+ pot utiliza alte surse de carbon decât glucoza pentru a menține activitatea mitocondrială (43, 44). Trebuie menționat că nu am observat nicio diferență în absorbția glucozei sau a activității mitocondriale între efectorii T CD4+, memoria efectorului T și celulele T de memorie centrală în ascită. În mod similar, starea de diferențiere a celulelor T CD8+ din tumori nu are nicio legătură cu modificările absorbției glucozei, evidențiind diferența semnificativă dintre celulele T cultivate in vitro și TIL uman in vivo (22). Aceste observații au fost confirmate și prin utilizarea alocării automate imparțiale a populației celulare, care a relevat în continuare că celulele CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ cu absorbție de glucoză și activitate mitocondrială mai mari decât celulele tumorale sunt predominante, dar au o populație celulară metabolic activă. Această populație poate reprezenta subpopulația presupusă de celule supresoare mieloide sau celule dendritice plasmocitoide identificate în analiza scRNA-seq. Deși ambele au fost raportate în tumorile ovariene umane [45], acestea necesită încă studii suplimentare pentru a descrie această subpopulație mieloidă.
Deși metodele bazate pe citometrie în flux pot clarifica diferențele generale în metabolismul glucozei și oxidativ între tipurile de celule, metaboliții preciși produși de glucoză sau alte surse de carbon pentru metabolismul mitocondrial în TME nu au fost încă determinați. Atribuirea prezenței sau absenței metaboliților unui anumit subset TIL necesită purificarea populației celulare din țesutul excizat. Prin urmare, metoda noastră de îmbogățire celulară combinată cu spectrometria de masă poate oferi informații despre metaboliții care sunt îmbogățiți diferențial în celulele T și populațiile de celule tumorale în probele de pacienți potrivite. Deși această metodă are avantaje față de sortarea celulelor activate prin fluorescență, anumite biblioteci de metaboliți pot fi afectate din cauza stabilității inerente și/sau a ratei rapide de rotație (22). Cu toate acestea, metoda noastră a reușit să identifice doi metaboliți imunosupresori recunoscuți, adenozina și kinurenina, deoarece aceștia variază foarte mult între tipurile de probe.
Analiza noastră metabonomică a tumorilor și subtipurilor de TIL oferă mai multe informații despre rolul metaboliților în TME ovarian. În primul rând, utilizând citometria în flux, am stabilit că nu există nicio diferență în activitatea mitocondrială între tumori și celulele T CD4+. Cu toate acestea, analiza LC-MS/MS a relevat modificări semnificative în abundența metaboliților în aceste populații, indicând faptul că concluziile despre metabolismul TIL și activitatea sa metabolică generală necesită o interpretare atentă. În al doilea rând, MNA este metabolitul cu cea mai mare diferență între celulele CD45 și celulele T în ascită, nu în tumori. Prin urmare, compartimentarea și localizarea tumorii pot avea efecte diferite asupra metabolismului TIL, ceea ce evidențiază posibila heterogenitate într-un anumit micromediu. În al treilea rând, expresia enzimei NNMT producătoare de MNA este limitată în principal la CAF, care este reprezentată într-o măsură mai mică de celule tumorale, dar se observă niveluri detectabile de MNA în celulele T derivate din tumori. Supraexprimarea NNMT în CAF ovarian are un efect cunoscut de promovare a cancerului, parțial datorită promovării metabolismului CAF, invaziei tumorale și metastazelor (27). Deși nivelul general de TIL este moderat, expresia NNMT în CAF este strâns legată de subtipul mezenchimal Cancer Genome Atlas (TCGA), care este asociat cu un prognostic slab (27, 46, 47). În cele din urmă, expresia enzimei AOX1 responsabilă de degradarea MNA este, de asemenea, limitată la populația CAF, ceea ce indică faptul că celulele T nu au capacitatea de a metaboliza MNA. Aceste rezultate susțin ideea că, deși sunt necesare studii suplimentare pentru a verifica această constatare, niveluri ridicate de MNA în celulele T pot indica prezența unui micromediu CAF imunosupresor.
Având în vedere nivelul scăzut de expresie al transportorilor de MNA și nivelurile nedetectabile ale proteinelor cheie implicate în metabolismul MNA, prezența MNA în celulele T este neașteptată. Nici NNMT, nici AOX1 nu au putut fi detectate prin analiza scRNA-seq și qPCR țintită a două cohorte independente. Aceste rezultate indică faptul că MNA nu este sintetizat de celulele T, ci este absorbit din TME înconjurător. Experimentele in vitro arată că celulele T tind să acumuleze MNA exogen.
Studiile noastre in vitro au arătat că MNA exogen induce exprimarea TNFα în celulele T și amplifică legarea Sp1 la promotorul TNFα. Deși TNFα are atât funcții antitumorale, cât și antitumorale, în cancerul ovarian, TNFα poate promova creșterea cancerului ovarian (31-33). Neutralizarea TNFα în cultura de celule tumorale ovariene sau eliminarea semnalului TNFα în modelele murine poate îmbunătăți producția de citokine inflamatorii mediate de TNFα și poate inhiba creșterea tumorii (32, 35). Prin urmare, în acest caz, MNA derivat din TME poate acționa ca un metabolit proinflamator printr-un mecanism dependent de TNFα prin bucla autocrină, promovând astfel apariția și răspândirea cancerului ovarian (31). Pe baza acestei posibilități, blocarea TNFα este studiată ca un potențial agent terapeutic pentru cancerul ovarian (37, 48, 49). În plus, MNA afectează citotoxicitatea celulelor CAR-T asupra celulelor tumorale ovariene, oferind dovezi suplimentare pentru imunosupresia mediată de MNA. Colectiv, aceste rezultate sugerează un model în care tumorile și celulele CAF secretă MNA în TME extracelular. Prin (i) stimularea creșterii cancerului ovarian indusă de TNF și (ii) inhibarea activității citotoxice a celulelor T indusă de MNA, acest lucru poate avea un efect tumoral dual (Figura 5D).
În concluzie, prin aplicarea unei combinații de îmbogățire celulară rapidă, secvențiere unicelulară și profilare metabolică, acest studiu a relevat diferențe imunometabolomice uriașe între tumori și celulele de ascită la pacienții cu HGSC. Această analiză cuprinzătoare a arătat că există diferențe în absorbția glucozei și activitatea mitocondrială între celulele T și a identificat MNA ca un metabolit imunoreglator autonom non-celular. Aceste date au un impact asupra modului în care TME afectează metabolismul celulelor T în cancerele umane. Deși a fost raportată competiția directă pentru nutrienți între celulele T și celulele canceroase, metaboliții pot acționa, de asemenea, ca regulatori indirecți pentru a promova progresia tumorii și, eventual, a suprima răspunsurile imune endogene. Descrierea suplimentară a rolului funcțional al acestor metaboliți reglatori poate deschide strategii alternative pentru amplificarea răspunsului imun antitumoral.
Probele pacienților și datele clinice au fost obținute prin intermediul depozitului de țesuturi tumorale canceroase din Columbia Britanică, certificat de Rețeaua Canadiană de Depozite de Țesuturi. Conform protocolului aprobat de Comitetul de Etică pentru Cercetarea Cancerului din Columbia Britanică și de Universitatea din Columbia Britanică (H07-00463), toate probele și datele clinice ale pacienților au obținut consimțământul informat în scris sau au renunțat în mod oficial la consimțământul lor. Probele sunt stocate în BioBank certificată (BRC-00290). Caracteristicile detaliate ale pacienților sunt prezentate în tabelele S1 și S5. Pentru crioconservare, se utilizează un bisturiu pentru a descompune mecanic proba tumorală a pacientului, apoi aceasta este împinsă printr-un filtru de 100 de microni pentru a obține o suspensie de celule individuale. Ascita pacientului a fost centrifugată la 1500 rpm timp de 10 minute la 4°C pentru a peleta celulele și a îndepărta supernatantul. Celulele obținute din tumoră și ascită au fost crioconservate în 50% ser uman AB inactivat termic (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) și 10% dimetilsulfoxid. Aceste suspensii de celule individuale conservate au fost decongelate și utilizate pentru metabolomică și determinarea metaboliților, așa cum este descris mai jos.
Mediul complet constă din RPMI 1640: AimV filtrat 0,22 μm, suplimentat 50:50. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamină (Thermo Fisher Scientific) suplimentat cu 10% ser uman AB inactivat termic (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamină (Thermo Fisher Scientific) (Fisher Scientific), 1 x soluție de penicilină-streptomicină (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) și 50 μMB-mercaptoetanol. AimV (Invitrogen) este suplimentat cu 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) și 2 mM l-glutamină (Thermo Fisher Scientific). Tamponul de colorare pentru citometrul de flux a constat din 0,22 μm soluție salină tamponată cu fosfat filtrată (PBS; Invitrogen) suplimentată cu 3% ser uman AB inactivat termic (Sigma). Tamponul de îmbogățire celulară este compus din PBS filtrat 0,22 μm și suplimentat cu 0,5% ser uman AB inactivat termic (Sigma-Aldrich).
Într-un mediu complet la 37°C, celulele au fost colorate cu 10 nM MT DR și 100 μM 2-NBDG timp de 30 de minute. Apoi, celulele au fost colorate cu colorantul de viabilitate eF506 la 4°C timp de 15 minute. Resuspendați celulele în FC Block (eBioscience) și Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluați în tampon de colorare pentru citometru în flux (conform instrucțiunilor producătorului) și incubați timp de 10 minute la temperatura camerei. Colorați celulele cu un set de anticorpi (Tabelul S2) în tampon de colorare pentru citometrie în flux la 4°C timp de 20 de minute. Resuspendați celulele în tampon de colorare pentru citometrie în flux (Cytek Aurora; configurație 3L-16V-14B-8R) înainte de analiză. Utilizați SpectroFlo și FlowJo V10 pentru a analiza datele privind numărul de celule și utilizați GraphPad Prism 8 pentru a crea datele. Intensitatea mediană a fluorescenței (MFI) a 2-NBDG și MT DR a fost normalizată logaritmic, iar apoi s-a utilizat un test t pereche pentru analiza statistică, pentru a ține cont de pacienții potriviți. Eliminați din analiză toate populațiile cu mai puțin de 40 de evenimente; introduceți o valoare MFI de 1 pentru orice valori negative înainte de a efectua analiza statistică și vizualizarea datelor.
Pentru a completa strategia de gating manuală a panoului de proces de mai sus, am utilizat adnotarea completă prin arborele de restricție a formei (FAUST) (21) pentru a atribui automat celulele populației după eliminarea celulelor moarte în FlowJo. Gestionăm manual rezultatul pentru a combina populațiile care par a fi alocate greșit (combinând celulele tumorale PD1+ cu PD1) și populațiile reținute. Fiecare probă conține o medie de peste 2% celule, pentru un total de 11 populații.
Centrifugarea cu densitate gradient de Ficoll a fost utilizată pentru a separa PBMC de produsele de separare a leucocitelor (STEMCELL Technologies). Celulele T CD8+ au fost izolate din PBMC folosind microsfere CD8 (Miltenyi) și expandate în mediu complet folosind TransAct (Miltenyi) timp de 2 săptămâni, conform instrucțiunilor producătorului. Celulele au fost lăsate să stea timp de 5 zile în mediu complet conținând IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), apoi restimulate cu TransAct. În ziua 7, conform instrucțiunilor producătorului, s-au utilizat microsfere CD45 umane (Miltenyi) pentru a îmbogăți celulele în trei runde consecutive. Celulele au fost împărțite în alicote pentru analiza prin citometrie în flux (așa cum este descris mai sus), iar un milion de celule au fost împărțite în alicote de trei ori pentru analiza LC-MS/MS. Probele au fost procesate prin LC-MS/MS așa cum este descris mai jos. Am estimat valoarea metabolitului lipsă cu un număr de ioni de 1.000. Fiecare probă este normalizată prin numărul total de ioni (TIC), convertită logaritmic și normalizată automat în MetaboAnalystR înainte de analiză.
Suspensia unicelulară a fiecărui pacient a fost decongelată și filtrată printr-un filtru de 40 μm în mediu complet (așa cum este descris mai sus). Conform protocolului producătorului, s-au utilizat trei runde consecutive de selecție pozitivă prin separare magnetică cu microsfere folosind MicroBeads (Miltenyi) pentru a îmbogăți probele cu celule CD8+, CD4+ și CD45- (pe gheață). Pe scurt, celulele sunt resuspendate în tampon de îmbogățire celulară (așa cum este descris mai sus) și numărate. Celulele au fost incubate cu microsfere CD8 umane, microsfere CD4 umane sau microsfere CD45 umane (Miltenyi) la 4°C timp de 15 minute, apoi spălate cu tampon de îmbogățire celulară. Proba este trecută prin coloana LS (Miltenyi), iar fracțiile pozitive și negative sunt colectate. Pentru a reduce durata și a maximiza etapa de recuperare a celulelor, fracția CD8 este apoi utilizată pentru a doua rundă de îmbogățire cu CD4+, iar fracția CD4 este utilizată pentru îmbogățirea ulterioară cu CD45. Se menține soluția pe gheață pe tot parcursul procesului de separare.
Pentru a pregăti probele pentru analiza metaboliților, celulele au fost spălate o dată cu soluție salină rece ca gheața și s-a adăugat 1 ml de metanol 80% la fiecare probă, apoi s-a vortexat și s-a congelat rapid în azot lichid. Probele au fost supuse la trei cicluri de congelare-decongelare și centrifugate la 14.000 rpm timp de 15 minute la 4°C. Supernatantul care conține metaboliții este evaporat până la uscare. Metaboliții au fost redizolvați în 50 μl de acid formic 0,03%, vortexați pentru a se amesteca și apoi centrifugați pentru a îndepărta resturile.
Extrageți metaboliții așa cum este descris mai sus. Transferați supernatantul într-o sticlă de cromatografie lichidă de înaltă performanță pentru cercetarea metabolomică. Utilizați un protocol de tratament aleatoriu pentru a trata fiecare probă cu un număr similar de celule pentru a preveni efectele de lot. Am efectuat o evaluare calitativă a metaboliților globali publicați anterior pe spectrometrul de masă triplu quadrupol AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Analiza cromatografică și integrarea ariei vârfurilor au fost efectuate utilizând software-ul MultiQuant versiunea 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Un număr de ioni de 1000 a fost utilizat pentru a estima valoarea metabolitului lipsă, iar TIC al fiecărei probe a fost utilizat pentru a calcula aria normalizată a vârfului fiecărui metabolit detectat pentru a corecta modificările introduse de analiza instrumentală din procesarea probelor. După normalizarea TIC, se utilizează MetaboAnalystR(51) (parametrul implicit) pentru conversia logaritmică și scalarea automată a liniei normei. Am utilizat PCA cu pachetul vegan R pentru a efectua o analiză exploratorie a diferențelor metabolomice dintre tipurile de probe și am utilizat analiza de redundanță parțială pentru a analiza pacienții. Am folosit metoda Ward pentru a construi o dendrogramă cu hartă termică pentru a grupa distanța euclidiană dintre probe. Am folosit limma (52) pentru abundența standardizată a metaboliților pentru a identifica metaboliții diferențiat abundenți în întregul tip de celulă și micromediu. Pentru a simplifica explicația, am folosit parametrul mediei grupului pentru a specifica modelul și am considerat tipurile de celule din micromediu ca fiecare grup (n = 6 grupuri); pentru testul de semnificație, am efectuat trei măsurători repetate pentru fiecare metabolit. Pentru a evita replicarea falsă, pacientul a fost inclus ca obstacol în designul limma. Pentru a verifica diferențele de metaboliți dintre diferiți pacienți, am ajustat modelul limma incluzând pacienții într-un mod fix. Raportăm semnificația contrastului pre-specificat dintre tipul de celulă și micromediul Padj <0,05 (corecția Benjamini-Hochberg).
După îmbogățirea vigorii utilizând kitul de îndepărtare a celulelor moarte Miltenyi (viabilitate >80%), a fost efectuată secvențierea transcriptomului unicelular pe probele totale de ascită și tumoră congelate vii, utilizând un protocol de expresie genică 10x 5′. Au fost analizate cinci cazuri cu tumori și ascită potrivite, deși viabilitatea scăzută a unei probe tumorale a împiedicat includerea acesteia. Pentru a realiza selecții multiple de pacienți, am combinat probele fiecărui pacient pe benzile controlerului de crom 10x și am analizat separat ascita și situsurile tumorale. După secvențiere [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp pereched end (PE), genomul Quebec; o medie de 73.488 și 41.378 citiri per celulă pentru tumoră și ascită, respectiv]], am folosit CellSNP și Vireo (53) (bazate pe CellSNP ca SNP uman comun (VCF) furnizat de GRCh38 are atribuită o identitate de donator. Folosim SNPRelate pentru a deduce cea mai apropiată identitate (IBS) a stării genotipice a pacientului (IBS), excluzând celulele neatribuite și celulele identificate ca duplexuri și potrivind donatorii între probele de ascită și tumoră (54). Pe baza acestei sarcini, am păstrat trei cazuri cu reprezentare celulară abundentă în tumoră și ascită pentru analiza ulterioară. După efectuarea unei etape de filtrare în masă în ambalajul BioConductor scater (55) și scran (56), aceasta a produs 6975 de celule (2792 și 4183 de celule din tumoră și ascită, respectiv) pentru analiză. Folosim gruparea Louvain a rețelei de vecini partajați (SNN) partajată (57) bazată pe distanța Jaccard față de celulele clusterului prin expresie. Clusterele au fost adnotate manual la tipurile de celule putative pe baza expresiei genelor marker și vizualizate cu t-SNE. Celulele T citotoxice sunt definite prin expresia CD8A și GZMA, excluzând subclusterele cu expresie scăzută a proteinelor ribozomale. Am accesat datele publicate de Izar și colab. (16), inclusiv încorporarea lor în t-SNE, care poate controla suprapunerea expresiei dintre markerii celulelor imune și expresia NNMT.
Celulele mononucleare de sânge (PBMC) au fost separate din produsele de separare a leucocitelor (STEMCELL Technologies) prin centrifugare cu densitate gradient Ficoll. Celulele CD3+ au fost izolate din PBMC folosind sfere CD3 (Miltenyi). În prezența sau absența MNA, celulele CD3+ au fost activate cu CD3 legat de placă (5 μg/ml), CD28 solubil (3 μg/ml) și IL-2 (300 U/ml; Proleukin). În ultima zi de expansiune, viabilitatea (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) și proliferarea (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) au fost evaluate prin citometrie în flux. Se evaluează funcția efectorului prin stimularea celulelor cu PMA (20 ng/ml) și ionomicină (1 μg/ml) cu GolgiStop timp de 4 ore și se monitorizează CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) și izotiocianat de TNFα-fluoresceină (FITC) (MAb11, BD). Se stimulează celulele qPCR și ChIP cu PMA (20 ng/ml) și ionomicină (1 μg/ml) timp de 4 ore. Supernatantul ELISA a fost colectat înainte și după stimularea cu PMA (20 ng/ml) și ionomicină (1 μg/ml) timp de 4 ore.
Urmați protocolul producătorului pentru a izola ARN-ul folosind kitul RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Utilizați QIAshredder (QIAGEN) pentru a omogeniza proba. Utilizați kitul ARN-ADNc de mare capacitate (Thermo Fisher Scientific) pentru a sintetiza ADN complementar (ADNc). Utilizați TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) pentru a cuantifica expresia genelor (conform protocolului producătorului) cu următoarele sonde: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehidă-3-fosfat de hidrogen (GAPDH)] și Hs01010726_m1 (SLC22A2). Probele au fost rulate pe sistemul PCR în timp real StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) pe placa de reacție optică rapidă MicroAmp cu 96 de godeuri (Applied Biosystems) cu film optic MicroAmp. Orice valoare Ct care depășește 35 este considerată a fi peste pragul de detecție și este marcată ca nedetectabilă.
Se efectuează ChIP așa cum s-a descris anterior (58). Pe scurt, celulele au fost tratate cu formaldehidă (concentrație finală 1,42%) și incubate la temperatura camerei timp de 10 minute. Se utilizează tampon de expandare suplimentat (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl și 0,1% NP-40) pe gheață timp de 10 minute, apoi se resuspendă în tampon de imunoprecipitare așa cum s-a descris (58). Proba a fost apoi sonicizată cu următoarele cicluri: 10 cicluri (20 de impulsuri de 1 secundă) și un timp static de 40 de secunde. Se incubează imunoglobulina G de grad ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) și anticorpii SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) cu proba la 4°CC, agitând peste noapte. Se incubează perlele de proteină A (Thermo Fisher Scientific) cu proba la 4°C, sub agitare ușoară, timp de 1 oră, apoi se utilizează perle chelex (Bio-Rad) pentru îmbogățirea ADN-ului și se utilizează proteinaza K (Thermo Fisher) pentru digestia proteinelor. Promotorul TNFα a fost detectat prin PCR: direct, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; dimpotrivă, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produs de 207 pb). Imaginile au fost produse de Image Lab (Bio-Rad) și cuantificate folosind software-ul ImageJ.
Supernatantul culturii celulare a fost colectat așa cum este descris mai sus. Determinarea a fost efectuată conform procedurilor producătorului pentru kitul ELISA TNFα uman (Invitrogen), kitul ELISA IL-2 uman (Invitrogen) și kitul ELISA IFN-γ uman (Abcam). Conform protocolului producătorului, supernatantul a fost diluat 1:100 pentru a detecta TNFα și IL-2 și 1:3 pentru a detecta IFN-γ. S-a utilizat cititorul multilabel EnVision 2104 (PerkinElmer) pentru a măsura absorbanța la 450 nm.
Celulele mononucleare de sânge (PBMC) au fost separate de produsele de separare a leucocitelor (STEMCELL Technologies) prin centrifugare cu densitate gradient Ficoll. Celulele CD3+ au fost izolate din PBMC folosind sfere CD3 (Miltenyi). În prezența sau absența MNA, celulele CD3+ au fost activate cu CD3 legat de placă (5 μg/ml), CD28 solubil (3 μg/ml) și IL-2 (300 U/ml; Proleukin) timp de 3 zile. După 3 zile, celulele au fost colectate și spălate cu soluție salină 0,9%, iar peleta a fost congelată rapid. Numărarea celulelor a fost efectuată prin citometrie în flux (Cytek Aurora; configurație 3L-16V-14B-8R) folosind 123 de sfere eBeads.
Se extrag metaboliții așa cum s-a descris mai sus. Extractul uscat a fost reconstituit la o concentrație de 4000 echivalenți celulari/μl. Se analizează proba prin cromatografie în fază inversă (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) și coloană CORTECS T3 (2,1×150 mm, dimensiunea particulelor 1,6 μm, dimensiunea porilor 120 Å; #186008500, Waters). Spectrometru de masă polar (6470, Agilent), în care ionizarea prin electrospray funcționează în mod pozitiv. Faza mobilă A este 0,1% acid formic (în H2O), faza mobilă B este 90% acetonitril, 0,1% acid formic. Gradientul LC este de la 0 la 2 minute pentru 100% A, 2 la 7,1 minute pentru 99% B și 7,1 la 8 minute pentru 99% B. Apoi, se reechilibrează coloana cu faza mobilă A la un debit de 0,6 ml/min timp de 3 minute. Debitul este de 0,4 ml/min, iar camera coloanei este încălzită la 50°C. Se utilizează standardul chimic pur MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) pentru a stabili timpul de retenție (RT) și transformarea (RT = 0,882 minute, transformarea 1 = 137→94,1, transformarea 2 = 137→92, conversia 3 = 137→78). Când toate cele trei tranziții au loc la timpul de retenție corect, tranziția 1 este utilizată pentru cuantificare pentru a asigura specificitatea. Curba standard a MNA (Toronto Research Chemical Company) a fost generată prin șase diluții seriale ale soluției stoc (1 mg/ml) pentru a obține standarde de 0,1, 1,0, 10 și 100 ng/ml și respectiv 1,0 și 10 μg/ml lichid. Limita de detecție este de 1 ng/ml, iar răspunsul liniar este între 10 ng/ml și 10 μg/ml. Fiecare injecție de doi microlitri de probă și standard este utilizată pentru analiza LC/MS, iar o probă mixtă de control al calității este rulată la fiecare opt injecții pentru a asigura stabilitatea platformei de analiză. Răspunsurile MNA ale tuturor probelor celulare tratate cu MNA s-au încadrat în intervalul liniar al testului. Analiza datelor a fost efectuată utilizând software-ul de analiză cantitativă MassHunter (v9.0, Agilent).
Construcția αFR-CAR de a doua generație a fost preluată de la Song și colab. (59). Pe scurt, construcția conține următoarele: secvența lider CD8a, fragment variabil cu lanț unic specific αFR uman, regiunea balama și transmembranară CD8a, domeniul intracelular CD27 și domeniul intracelular CD3z. Secvența CAR completă a fost sintetizată prin GenScript și apoi clonată în vectorul de expresie lentiviral de a doua generație, în amonte de caseta de expresie GFP utilizată pentru a evalua eficiența transducției.
Lentivirusul este produs prin transfecția celulelor HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco conținând 10% ser fetal bovin (FBS) și 1% PenStrep și utilizând vectorul CAR-GFP, iar plasmidele de împachetare (psPAX2 și pMD2.G, Addgene) utilizează amină de lipofecție (Sigma-Aldrich). Supernatantul care conține virusul a fost colectat la 48 și 72 de ore după transfecție, filtrat și concentrat prin ultracentrifugare. Supernatantul viral concentrat se depozitează la -80°C până la transducție.
Celulele mononucleare de sânge (PBMC) sunt separate de produsele de separare a leucocitelor donatoare sănătoase (STEMCELL Technologies) prin centrifugare cu densitate gradientă Ficoll. Se utilizează microsfere CD8 cu selecție pozitivă (Miltenyi) pentru a izola celulele CD8+ din PBMC. Se stimulează celulele T cu TransAct (Miltenyi) și în mediu TexMACS [Miltenyi; suplimentat cu 3% ser uman inactivat termic, 1% PenStrep și IL-2 (300 U/ml)]. La douăzeci și patru de ore după stimulare, celulele T au fost transduse cu lentivirus (10 μl de supernatant de virus concentrat per 10⁶ celule). La 1 până la 3 zile după transducția pe Cytek Aurora (pe FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), se evaluează expresia GFP a celulelor pentru a demonstra o eficiență a transducției de cel puțin 30%.
Celulele CAR-T au fost cultivate timp de 24 de ore în Immunocult (STEMCELL Technologies; suplimentat cu 1% PenStrep) în următoarele condiții: netratate, tratate cu 250 μM adenozină sau 10 mM MNA. După pretratare, celulele CAR-T au fost spălate cu PBS și combinate cu 20.000 de celule SK-OV-3 [ATCC; în mediu McCoy 5A (Sigma-Aldrich) suplimentat cu 10% FBS și 1% PenStrep la 10°C: Raportul efector-țintă de 1 a fost amplificat în triplicat în mediu Immunocult suplimentat. Celulele SK-OV-3 și celulele SK-OV-3 lizate cu saponină digitalică (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) au fost utilizate ca și controale negative, respectiv pozitive. După 24 de ore de co-cultivare, supernatantul a fost colectat și lactat dehidrogenaza (LDH) a fost măsurată conform instrucțiunilor producătorului (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatantul LDH a fost diluat 1:50 în tampon LDH. Procentul de ucidere a fost măsurat folosind următoarea formulă: procent de ucidere = procent de corecție / rată maximă de ucidere x 100%, unde procent de corecție = co-cultură - numai celule T, iar rata maximă de ucidere = control pozitiv - control negativ.
Așa cum este descris în text sau în materiale și metode, utilizați GraphPad Prism 8, Microsoft Excel sau R v3.6.0 pentru analiza statistică. Dacă se recoltează mai multe probe de la același pacient (cum ar fi ascită și tumoră), folosim un test t pentru perechi sau includem pacientul ca efect aleatoriu într-un model liniar sau generalizat, după caz. Pentru analiza metabolomică, testul de importanță se efectuează în triplicat.
Pentru materiale suplimentare pentru acest articol, vă rugăm să consultați http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Acesta este un articol cu ​​acces liber, distribuit în conformitate cu termenii Licenței Creative Commons Attribution-Non-Commercial, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea în orice mediu, atâta timp cât utilizarea finală nu este în scop comercial și premisa este că lucrarea originală este corectă. Referință.
Notă: Vă rugăm doar să ne furnizați adresa dvs. de e-mail, astfel încât persoana pe care o recomandați paginii să știe că doriți ca aceasta să vadă e-mailul și că nu este spam. Nu vom colecta nicio adresă de e-mail.
Această întrebare este folosită pentru a testa dacă sunteți vizitator și pentru a preveni trimiterea automată de spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini De Russel Jones (Ralph J. De Bellardini) G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA contribuie la imunosupresia celulelor T și reprezintă o potențială țintă imunoterapică pentru tratamentul cancerului uman.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini De Russel Jones (Ralph J. De Bellardini) G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA contribuie la imunosupresia celulelor T și reprezintă o potențială țintă imunoterapică pentru tratamentul cancerului uman.
©2021 Asociația Americană pentru Progresul Științei. Toate drepturile rezervate. AAAS este partener al HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef și COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.